易玉玲，雍江堰，祖瑞鈴，李燕

臨床難治的耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin resistant S.epidermidis，MRSE）主要耐藥機(jī)制與mecA基因編碼產(chǎn)生的新青霉素結(jié)合蛋白2a（penicillin binding protein 2a，PBP2a）有關(guān)，且具有生物膜形成能力的MRSE可能會因?yàn)樯锬?nèi)營養(yǎng)供給、氧濃度、滲透壓等內(nèi)環(huán)境的改變，導(dǎo)致其耐藥基因被激活或發(fā)生基因水平的轉(zhuǎn)移，造成耐藥增強(qiáng)而增加臨床治療難度[1～2]。因此，研究可以抑制生物膜陽性MRSE的藥物或方法十分必要。

已有研究表明中藥及其活性單體成分與抗生素聯(lián)用后對細(xì)菌生物膜的抑制作用增強(qiáng)，并且可能會逆轉(zhuǎn)MRS的耐藥性[3]。活血化瘀藥物丹參，其有效成分丹參酮類化合物具有抗菌、抗炎作用，但目前研究其抑制生物膜的臨床研究和應(yīng)用較少。在本課題組前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮與氨芐西林聯(lián)用能協(xié)同抑制MRSE浮游菌與生物膜細(xì)菌，故本研究以MRSE耐藥基因?yàn)榘悬c(diǎn)，研究藥物對生物膜陽性的MRSE mecA、PBP2a表達(dá)的影響，初步探討丹參活性單體與抗生素聯(lián)用對MRSE耐藥逆轉(zhuǎn)的可能性，為防治生物膜陽性MRSE感染尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 SE生物膜陽性參考菌株SE1457（復(fù)旦大學(xué)瞿滌教授惠贈），生物膜陽性臨床菌株SE15569、SE21021、SE21306、SE26508和SE30291[4～5]：經(jīng)鑒定均對苯唑西林耐藥，即苯唑西林對每株菌的 MIC≥ 4 μg·mL-1，判斷為MRSE。

1.1.2 主要試劑、藥物及儀器 二氫丹參酮Ⅰ對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）。MHB、TSB培養(yǎng)基（青島海博生物科技有限公司）；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性測試試劑盒XTT（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Trizol Reagent（Invitrogen）；M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit（Omega）；TransStart Green qPCR SuperMIX（北京全式金公司）。PCR儀（BIO-RAD）；酶標(biāo)儀（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；微量核酸蛋白分析儀（THERMO）；熒光定量PCR儀（德國耶拿公司）。

1.2 方法

1.2.1 MRSE臨床菌株中mecA陽性株的篩選

1.2.1.1 引物設(shè)計(jì) NCBI查詢SE mecA基因的序列并設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成，引物擴(kuò)增序列和產(chǎn)物片段大小見表1。

表1 mecA基因特異性引物序列

1.2.1.2 MecA基因的擴(kuò)增 將5株MRSE臨床菌株于血平板上復(fù)蘇，挑取SE菌落于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。吸取菌液于無菌EP管中，離心后棄上清，加入適量TE溶液，強(qiáng)烈振蕩洗滌菌體，離心后收集菌體。加入TE溶液懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度2 μg·mL-1，充分混勻，37℃孵育后，加入10%SDS溶液于37℃裂解，然后加入蛋白酶K于70℃消化，100℃煮沸后離心，收集上清液即為DNA模板。

PCR反應(yīng)按照博邁德2×Taq PCR MasterMix說明書進(jìn)行操作。 PCR反應(yīng)條件設(shè)置：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30s，52℃退火30 min，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)反應(yīng)5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 qRT-PCR檢測藥物對生物膜陽性MRSE mecA基因表達(dá)的影響

1.2.2.1 生物膜的建立 先用TSB培養(yǎng)基復(fù)蘇-20℃保存的菌株搖床震蕩1h,血平板37℃、24h傳代2次后,再配制成濃度為1×106CFU·mL-1的菌懸液，在無菌6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h SE生物膜。每孔加入3mL液處理，分為2 μg·mL-1二氫丹參酮Ⅰ+ 2 μg·mL-1氨芐西林聯(lián)用組、2 μg·mL-1氫丹參酮Ⅰ組、2 μg·mL-1氨芐西林組，另設(shè)置64 μg·mL-1萬古霉素作為陽性藥物干預(yù)組、不加藥的對照組，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 qRT-PCR檢測mecAmRNA 參照Trizol Reagent說明書采用Trizol法提取SE生物膜RNA，然后取RNA樣品液1μL，利用Thermo微量核酸蛋白分析儀測定其濃度。按照Omega的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-70℃保存。按照TransStart Green qPCR SuperMIX試劑盒檢測生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，熒光定量PCR反應(yīng)條件設(shè)置：第一步94℃預(yù)變性30s，第二步94℃變性5s，第三步52℃退火15s，第四步72℃延伸10s，40個循環(huán)，并于每個循環(huán)的延伸階段收集熒光信號；60-95℃做溶解曲線，以16SrRNA為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct法計(jì)算各目的基因的相對定量。

1.2.3 ELISA檢測藥物對MRSE的PBP2a表達(dá)的影響 參照1.2.2.1方法，在6孔板中加入無菌玻片建立生物膜。培養(yǎng)結(jié)束后用液氮碾磨玻片并收集粉末，按照通用蛋白裂解液說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，取適量裂解液稀釋PSMF為1mM。加入EP管中、混勻，置于冰上裂解后，離心取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定，配置BCA工作液，制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將蛋白加入樣品孔中，每孔加入BCA工作液，37℃避光孵育，酶標(biāo)儀測定A570，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照 ELISA試劑盒說明書檢測PBP2a蛋白的表達(dá)，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度結(jié)果將每組蛋白模板稀釋至相同濃度，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔。除空白孔外每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃孵育，洗滌5次，每孔加入底物A、B，37℃避光孵育后加反應(yīng)終止液50μL，酶標(biāo)儀檢測A450，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各實(shí)驗(yàn)組之間的差異性比較，通過SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（o n e-w a y ANOVA），每個藥物組設(shè)置8個復(fù)孔，整個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 mecA基因陽性菌株的篩選結(jié)果

根據(jù)電泳結(jié)果，5株臨床MRSE中mecA基因陽性的菌株為SE21021、SE26508和SE30291，擴(kuò)增mecA基因的電泳圖如圖1所示。

圖 1 SE26508、 SE21021 、SE30291 mecA基因擴(kuò)增電泳圖

2.2 二氫丹參酮Ⅰ與氨芐西林聯(lián)用對生物膜陽性MRSE的mecA基因表達(dá)的影響

藥物干預(yù)MRSE中mecA基因的表達(dá)情況見圖2

對于SE21021，與二氫丹參酮Ⅰ單用和萬古霉素組相比，2 μg·mL-1二氫丹參酮Ⅰ與2 μg·mL-1氨芐西林聯(lián)用能明顯降低mecA的表達(dá)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與氨芐西林單用組相比，聯(lián)用組也能降低mecA的表達(dá)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對于SE26508，各組藥物均促進(jìn)mecA基因的表達(dá)（P＜0.05），但是聯(lián)用組mecA基因的表達(dá)低于氨芐西林單用組、二氫丹參酮Ⅰ單用組和萬古霉素組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對于SE30291，聯(lián)用組、氨芐西林單用組和二氫丹參酮Ⅰ單用組均降低了mecA表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），萬古霉素則促進(jìn)了mecA基因的表達(dá)（P＜0.05），因而聯(lián)用組比萬古霉素的抑制作用好且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 藥物干預(yù)后臨床菌株生物膜中mecA基因相對表達(dá)情況

2.3 二氫丹參酮Ⅰ與氨芐西林聯(lián)用對生物膜陽性MRSE的PBP2a蛋白表達(dá)的影響

ELISA測定PBP2a蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，x軸代表標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng·μL-1），y軸代表吸光度，得到濃度與吸光度之間的線性關(guān)系為y = 0.0012x+ 0.0321，R2 = 0.9979，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到各組的PBP2a的表達(dá)量如圖4所示。

從圖4中可以看出，對于三株MRSE盡管已經(jīng)使用了濃度已相對較高（64 μg·mL-1）的萬古霉素，但是萬古霉素對它們的抑制作用并不理想。對于SE21021，各組藥物均抑制了PBP2a的表達(dá)（P＜0.05），且聯(lián)用組的PBP2a蛋白（301.50 ng·μL-1±13.26）比氨芐西林單用組（329.82 ng·μL-1±2.15）、萬古霉素組（360.26 ng·μL-1±9.26）都低（P＜0.05），但比二氫丹參酮Ⅰ單用組（294.48 ng·μL-1±2.07）高（P＞0.05）。對于SE26508，除萬古霉素組，其他各組藥物均抑制了PBP2a的表達(dá)，但只有氨芐西林單用組（187.47 ng·μL-1±3.74）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)用組PBP2a（224.27 ng·μL-1±10.53）的表達(dá)低于萬古霉素組（250.90 ng·μL-1±8.21）且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高于氨芐西林單用組、二氫丹參酮Ⅰ單用組（218.27 ng·μL-1±8.89）但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對于SE30291，各組藥物均抑制了PBP2a的表達(dá)，除了萬古霉素組，其余組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；聯(lián)用組的PBP2a蛋白（220.56 ng·μL-1±11.29）比氨芐西林單用組（329.82 ng·μL-1±2.15）、萬古霉素組（213.44 ng·μL-1±5.74）都高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是比二氫丹參酮Ⅰ單用組（232.35 ng·μL-1±7.00）低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 PBP2a定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 藥物干預(yù)后臨床菌株生物膜中PBP2a蛋白定量結(jié)果

3 討論

MRSE是臨床重要的多重耐藥菌之一，其耐藥機(jī)制主要與mecA基因編碼產(chǎn)生新的青霉素結(jié)合蛋白-PBP2a有關(guān)。轉(zhuǎn)肽酶PBP2a與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力極低，當(dāng)正常的PBPs被β-內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合而失去活性時，PBP2a能代替其功能，促進(jìn)肽聚糖合成，維持SE的生長，從而導(dǎo)致其對β-內(nèi)酰胺類等多種臨床常用抗生素耐藥。而生物膜內(nèi)環(huán)境的改變可激活耐藥基因的表達(dá)，甚至影響基因表達(dá)譜，發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，其中少數(shù)細(xì)菌的耐藥性會傳遞給其他細(xì)菌[6]，導(dǎo)致SE生物膜內(nèi)mecA基因攜帶細(xì)菌越來越多，從而增加對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。因此研究可以抑制生物膜陽性MRSE的藥物或方法可以有效控制臨床MRSE的傳播。

針對MRS的治療，一篇發(fā)表在Nature Chemical Biology上的文章指出哌拉西林、美羅培南、他唑巴坦組合使用可以協(xié)同抑制MRSA，并破壞細(xì)菌細(xì)胞壁。在小鼠感染模型中，三藥聯(lián)用方案與利奈唑胺同樣有效，因此可見β-內(nèi)酰胺類抗生素與其他抗生素聯(lián)用是可以恢復(fù)對MRSA的抑制作用[7]。另外有些研究[8～9]還發(fā)現(xiàn)從天然藥物中提取的有效成分與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用可以協(xié)同抑制MRS，如Carolina等[8]發(fā)現(xiàn)從八寶樹中提取的成分F-10可以協(xié)同β-內(nèi)酰胺類抗生素通過降低PBP2a的表達(dá)來抑制MRSA，段德軍[9]等人發(fā)現(xiàn)丹參酮與氨芐西林、頭孢唑啉聯(lián)用可以增強(qiáng)對MRSA的抑制作用，同時還可以增強(qiáng)MRSA對萬古霉素的敏感性。

本課題組前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)二氫丹參酮與氨芐西林聯(lián)用具有對MRSE浮游菌與生物膜細(xì)菌的協(xié)同抑菌作用，故本研究以MRSE耐藥基因?yàn)榘悬c(diǎn)，分析藥物對生物膜陽性的MRSE mecA、PBP2a表達(dá)的影響，初步探討丹參活性單體與抗生素聯(lián)用對MRSE耐藥逆轉(zhuǎn)的可能性。其結(jié)果顯示：對于SE21021，氨芐西林和二氫丹參酮Ⅰ聯(lián)用可以抑制mecA基因的表達(dá)，降低PBP2a蛋白的含量，并且與氨芐西林單用相比能降低PBP2a蛋白的表達(dá)，這說明聯(lián)用可能具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。對于SE30291，藥物聯(lián)用后具有抑制mecA基因表達(dá)的作用，并且抑制幅度大于氨芐西林單用組，但PBP2a蛋白的表達(dá)卻比氨芐西林單用高。對于SE26508，聯(lián)用之后反而促進(jìn)了mecA的表達(dá)。說明聯(lián)用后不能100%的抑制所有菌株mecA的表達(dá)。同時，我們發(fā)現(xiàn)藥物對mecA和PBP2a蛋白表達(dá)的抑制存在著不一致的現(xiàn)象：在SE26508，藥物聯(lián)用后促進(jìn)了mecA的表達(dá)，但降低了PBP2a的表達(dá)，其可能的原因是：盡管mecA是PBP2a的編碼基因，但mecA的其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制會影響PBP2a的合成。有研究證實(shí)[10]mecA轉(zhuǎn)錄形式包括組成型、誘導(dǎo)型與延遲誘導(dǎo)型。mecRI-mecI系統(tǒng)調(diào)控組成型轉(zhuǎn)錄方式，其調(diào)控mecA基因的表達(dá)水平與PBP2a蛋白表達(dá)成正相關(guān)。而blaRI-blaI系統(tǒng)控制誘導(dǎo)型與延遲誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄方式，PBP2a的合成需要β-內(nèi)酰胺類抗生素的誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生，因而mecA基因與PBP2a蛋白表達(dá)水平并非完全一致。

綜上，由于本次實(shí)驗(yàn)選擇的菌株數(shù)較少，且使用同一濃度藥物作用的效果也不盡相同，因此尚不能得出二氫丹參酮Ⅰ和氨芐西林聯(lián)用對MRSE具有耐藥逆轉(zhuǎn)的作用，需加大菌株數(shù)量、增加生物膜形成前后耐藥基因表達(dá)水平和耐藥表型檢測以進(jìn)一步探求和驗(yàn)證。

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