分批補料式高密度培養(yǎng)植物乳桿菌的研究

盧富山，尹清強，趙衛(wèi)衛(wèi)，王 瀟

(1.河南普愛飼料股份有限公司，河南 周口 466100；2.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具備免疫調(diào)節(jié)、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等很多保健作用[1]。植物乳桿菌微生態(tài)制劑的制備，關(guān)鍵技術(shù)就是高密度培養(yǎng)，限制乳酸菌增殖的關(guān)鍵因素是有機酸的積累和發(fā)酵底物的消耗。在發(fā)酵進入對數(shù)生長后期，乳酸以及其他有機酸的生成導致pH的下降，在pH降為4.0左右時，就會抑制乳酸菌的生長，這時對數(shù)生長期的細胞繁殖就會被破壞[2]；同時，底物的大量消耗也限制了微生物的持續(xù)增長。補料分批培養(yǎng)能夠有效中和過多的酸并補充缺失的營養(yǎng)素，在流加補料液的過程中，通過應用低濃度初糖并且在發(fā)酵過程中連續(xù)補料[3]和調(diào)整至最適pH值，使菌體數(shù)量在發(fā)酵結(jié)束時能夠獲得很大提高，對乳酸菌進行大規(guī)模培養(yǎng)具有一定的指導意義[4-5]。本研究對植物乳桿菌進行補料分批培養(yǎng)，找出培養(yǎng)過程中有效的限制性營養(yǎng)因子[6]和最優(yōu)調(diào)整pH方式，以此獲得高密度細胞培養(yǎng)方法，解決植物乳桿菌發(fā)酵劑制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 植物乳酸桿菌(L.plantarum)CICC 20265，購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基(MRS)：葡萄糖2%、胰蛋白胨1%、牛肉蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、NaAc 0.5%、K2HPO40.2%、MgSO40.058%、MnSO40.025%、檸檬酸二胺0.2%、吐溫80為0.1 mL、pH為6.2～6.4。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、胰蛋白胨1.4%、NaCl 0.25%、MgSO40.1%、K2HPO40.5%、NaAc 0.3%。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 接種凍干保藏的菌種于種子培養(yǎng)基，于37 ℃靜止培養(yǎng)18 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將制備的種子液按照1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃靜止培養(yǎng)18 h，即為后續(xù)試驗用發(fā)酵液。

1.2.3 分批補料式高密度培養(yǎng)[7]乳酸菌在37 ℃下培養(yǎng)至12 h進入對數(shù)生長末期，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度在5 g/L左右。然后在對數(shù)生長期，采用不同的分批補料手段向發(fā)酵液中添加新鮮的補料液，同時添加堿液保持pH值為6.5。

首先在500 mL培養(yǎng)瓶中裝入200 mL發(fā)酵液，對乳酸菌進行補料分批培養(yǎng)研究，探討對數(shù)生長末期限制微生物生長的限制性底物，以活菌數(shù)為參照，研究補料時的最適中和劑和補料液的最佳碳氮比。

在發(fā)酵12 h后，向發(fā)酵液中分別加入不同配比的補料液，通過測定補料后活菌數(shù)的變化，研究限制微生物增殖的營養(yǎng)要素以及發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源最佳配比。將發(fā)酵培養(yǎng)基按照營養(yǎng)組分為2組：葡萄糖(L1,30 g/L)和蛋白胨(L2，28 g/L)。

在發(fā)酵12 h后，分別選擇1 mol/L的KOH、Na2CO3溶液、氨水和醋酸鈉為中和劑，調(diào)解pH到最適，最終通過測定活菌數(shù)選擇最佳的中和劑。

在確定補料液最佳碳氮比和最適中和劑后，進行10 L發(fā)酵罐擴大實驗，運用恒速流加、葡萄糖反饋流加等補料方式，將碳氮比為5∶7的補料液注入發(fā)酵罐并同時調(diào)整pH值，通過測定活菌數(shù)的變化，探究最佳分批補料方式。

1.2.4 活菌計數(shù)方法 將發(fā)酸液按10的倍數(shù)進行稀釋，取1 mL稀釋液涂布于的固體培養(yǎng)基上，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，計算發(fā)酵液中活菌數(shù)(CFU/mL)，并用自然對數(shù)(lg)表示。

1.2.5 pH值的測定 采用PHS-3C精密酸度計直接測定發(fā)酵液的pH值。

1.2.6 還原糖的測定 采用DNS法。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始葡萄糖濃度對植物乳桿菌生長的影響

由表1可知：葡萄糖質(zhì)量濃度在5～15 g/L范圍內(nèi)，菌體濃度隨初糖質(zhì)量濃度增大而增加；當葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/L時，菌體濃度最大；初始糖濃度繼續(xù)增加，菌體濃度降低。由此可以看出在一定范圍內(nèi)，增加初始糖質(zhì)量濃度可以促進細胞增殖，但過高的底物濃度反而抑制了細胞的增殖。

Combining the mathematical model defined by Eqs.(1)–(3),the transfer function of the hydraulic section is

2.2 起始氮源濃度對植物乳桿菌生長的影響

配制不同蛋白胨含量的培養(yǎng)基，含量分別為6、10、14、16、18 g/L，其他成分相同，裝液量100/250 mL，接種量3%，培養(yǎng)24 h后測活菌數(shù)。

表1 不同初糖濃度對活菌數(shù)的影響

由表2可以看出，14、16、18 g/L下的活菌數(shù)差異不明顯，但14 g/L下的活菌數(shù)最高，用量也較少，確定氮源初始濃度為14 g/L。

表2 不同氮源濃度對活菌數(shù)的影響

2.3 最適pH的確定

將液體培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，37 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h后，檢測其活菌數(shù)。由表3可以看出，發(fā)酵液初始pH為7.0～7.5時活菌數(shù)最高。

表3 不同初始pH對活菌數(shù)的影響

2.4 限制性底物的確定

補料分批培養(yǎng)首先要確定對數(shù)生長末期限制微生物增殖的營養(yǎng)因子。由圖1可知，在微生物生長進入穩(wěn)定期時，菌體OD值達到0.2976，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降至2 g/L，表明葡萄糖的損耗可能是限制微生物繼續(xù)增殖的因素。

微生物的增殖需要多種營養(yǎng)因子，那么培養(yǎng)基到對數(shù)末期可能還存在其他限制性營養(yǎng)因子。因此本試驗設(shè)計了3種補料液，分別為補料液L1(10 mL)、補料液L2(10 mL)、補料液L1(5 mL)+ L2(5 mL)，在分批培養(yǎng)至對數(shù)生長末期(12 h)，將上述補料液分別一次性加入200 mL的發(fā)酵培養(yǎng)液，在補料培養(yǎng)階段調(diào)節(jié)pH值在7左右，培養(yǎng)22 h后結(jié)束發(fā)酵，測得其活菌數(shù)變化(表4)。

在發(fā)酵平穩(wěn)期加入補料液L1，22 h后菌體濃度增加，這表明分批培養(yǎng)末期的細胞增殖停止是由碳源匱乏引起的。當補料液中含有氮源時(L2及L1+L2)，菌體總量有所增加，這表明氮源也是對數(shù)生長末期的限制性營養(yǎng)因子，需要在分批補料過程中加入補料液。

圖1 植物乳酸桿菌生長過程變化表4 不同補料類型對活菌數(shù)的影響

補料類型終pH活菌數(shù)/(CFU/mL)L14.719.18±0.012 BL27.048.79±0.13 CL1+L24.659.30±0.03 AB空白3.778.57±0.06 C

注：空白表示未進行補料。

2.5 補料液最適碳氮比的確定

在補料液中，葡萄糖(L1)添加量不變(5 mL)，增加蛋白胨的添加量。在前4組實驗中，隨著蛋白胨添加量的增加，活菌數(shù)也隨之提高，并且差異顯著。這主要是由于補料液中蛋白胨含量較少。當?shù)鞍纂颂砑恿?L2)增加到7 mL時，獲得了最大的活菌數(shù)；繼續(xù)增加蛋白胨則活菌數(shù)趨于穩(wěn)定且差異不顯著，此時可能葡萄糖的缺乏又成為關(guān)鍵因素。所以在補料試驗中，確定補料液中的C/N(體積比)為5∶7。

表5 不同碳氮比的補料液對活菌數(shù)的影響

2.6 中和劑的選擇

在乳酸桿菌高密度培養(yǎng)過程中往往通過流加堿液來消除酸的反饋抑制[7]。本實驗選擇KOH、Na2CO3溶液、氨水和醋酸鈉為中和劑，按確定的適宜條件進行發(fā)酵，在對數(shù)生長末期一次性補料的同時選用不同的中和劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值到7，并比較不同中和劑對植物乳桿菌高密度培養(yǎng)的影響，中和劑的濃度為1 mol/L，測定培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)。

在乳酸菌的靜止培養(yǎng)過程中，大量乳酸以及其它有機酸積累會對細胞的分裂增殖產(chǎn)生反饋抑制[8]。植物乳桿菌在高密度培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生大量的有機酸，在培養(yǎng)過程中加入中和劑后，氫氧化鈉能快速恢復降低的pH值，醋酸鈉作為緩沖劑能穩(wěn)定發(fā)酵液的pH值。綜上，試驗確定氫氧化鈉+醋酸鈉為最適中和劑(表6)。

表6 不同中和劑對活菌數(shù)的影響

2.7 最適補料方式的確定

首先應用恒速補料策略進行高密度培養(yǎng)，以2 g/(L·h)(以葡萄糖計) 的補料速度向發(fā)酵液中加入C/N為5∶7 (體積比)的補料液，同時每隔2 h調(diào)節(jié)一次pH值至7。

葡萄糖反饋補料策略：通過對補料液補料速度的調(diào)節(jié)來實施葡萄糖反饋補料控制，根據(jù)培養(yǎng)液內(nèi)的葡萄糖濃度的變化及時調(diào)整葡萄糖添加量，使葡萄糖濃度維持在一個合適的范圍內(nèi)。雖然確定殘?zhí)堑馁|(zhì)量濃度需要1 h的間隔時間，但可以粗略地保持一個所需的低殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(1.0～1.5 g/L)，在該條件下，培養(yǎng)24 h。

由圖2可知，葡萄糖反饋流加效果最好，活菌濃度能達到3.1×109CFU/mL；而恒速流加能達到2.4×109CFU/mL；兩種流加培養(yǎng)方式[9-10]的活菌數(shù)都高于靜止培養(yǎng)。葡萄糖反饋流加是將發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度控制在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵液中碳氮源、pH值在最適水平，有利于微生物細胞的增殖；而恒速流加能夠在發(fā)酵前期提供給乳酸菌生長的營養(yǎng)要素，到對數(shù)生長期，微生物生長迅速，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗速度已經(jīng)大于補料速度，后期則不能滿足菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。因此，葡萄糖反饋流加方法更適合植物乳桿菌的高密度培養(yǎng)。

圖2 不同補料方式下活菌數(shù)的變化

3 討論

本研究首先確定了補料液的組分與配比，確定了最佳的中和劑組合模式。通過流加不同組分、不同配比的補料液，發(fā)現(xiàn)碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨)是植物乳桿菌增殖的限制性底物，從而確定了葡萄糖和蛋白胨混合物為補料分批培養(yǎng)過程中需要補加的營養(yǎng)素，并在此基礎(chǔ)上確定了補料液的最優(yōu)碳氮比5∶7。同時，乳酸菌在生長過程中不斷代謝糖類產(chǎn)生乳酸和其他有機酸，使得培養(yǎng)液酸度不斷增加，乳酸菌的生長受到低pH值的抑制，因此在補料同時向培養(yǎng)基中加入中和劑來調(diào)解pH值，使用緩沖劑來維持pH值在一定范圍內(nèi)，最終選用氫氧化鈉和醋酸鈉組合為最優(yōu)中和劑。

為了研究更好的補料分批高密度培養(yǎng)法，本研究比較了2種流加模式，恒速流加模式雖然能夠平穩(wěn)地向培養(yǎng)液中補充營養(yǎng)要素，在前期一定程度上滿足了微生物的營養(yǎng)需求，但到了對數(shù)生長中后期細胞增殖迅速，恒速流加就無法滿足細胞增殖的營養(yǎng)需求，因此會限制菌體的快速生長。葡萄糖反饋補料被證實為最佳的，這種流加方式能將發(fā)酵液中葡萄糖控制在一定的范圍內(nèi)，并且通過內(nèi)部營養(yǎng)需求調(diào)整營養(yǎng)要素供給量，所以最終獲得了較高的細胞濃度，活菌數(shù)達到3.1×109CFU/mL，最終使用葡萄糖反饋流加可以使活菌數(shù)提高4倍。

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