三種培養(yǎng)基對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)生長和數(shù)量影響的比較

高健偉，郭紅燕，李艷生

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)及臨床有廣泛的應(yīng)用，取得了很多很好的成果，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)；但干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增還存在較多問題，很多因素都可能導(dǎo)致原代干細(xì)胞體外培養(yǎng)失?。ㄈ邕x擇培養(yǎng)基、血清、臍帶質(zhì)量、無菌情況、技術(shù)操作等），即使成功培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs），其生長狀態(tài)不良、數(shù)量少、細(xì)胞收集不足等情況，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。筆者對(duì)目前使用的三種不同培養(yǎng)基進(jìn)行原代干細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)其觀察細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量的結(jié)果具體分析如下。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基、試劑和儀器 低糖DMEM、高糖DMEM、DMEM/F12（均使用 HyClone），青霉素和鏈霉素 100×（Solabio），15%FBS（Gibco），培養(yǎng)皿（美國康寧），倒置顯微鏡 （100×），熒光倒置顯微鏡（100×）。

1.2 不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿孔數(shù)計(jì)數(shù) 全部采用同一廠家6孔培養(yǎng)板，同一培養(yǎng)板只能用一種培養(yǎng)基，共3板，1孔為一份標(biāo)本，共18份標(biāo)本。

1.3 培養(yǎng)時(shí)間和觀察內(nèi)容 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，分別是 7、10、15、20、25 d， 在不同時(shí)間點(diǎn)觀察不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞游出面積、細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。

1.4 臍帶采集和培養(yǎng) 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)采用組織塊貼壁法進(jìn)行，同一嬰兒的臍帶進(jìn)行三種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)。足月、健康剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的新鮮、無菌、健康的新生兒臍帶長約24 cm，用4℃無菌恒溫盒儲(chǔ)存運(yùn)輸，即刻消毒，用PBS（含1∶1000的青霉素和鏈霉素）反復(fù)沖洗表面血跡和血管內(nèi)殘留血液，清洗徹底干凈，隨后用組織剪剪取干凈、清亮、飽滿部分的臍帶，每一段長約1 cm，挑選取用18段用PBS再次反復(fù)沖洗。沖洗干凈后用血管鉗和眼科剪細(xì)心分離先將臍帶靜脈和動(dòng)脈去除，然后去除羊膜，剩余即為華通膠。取無菌一次性培養(yǎng)皿用眼科剪將華通膠一般剪成1 mm×1 mm×1 mm組織塊，平均分別種在一次性無菌6孔板的培養(yǎng)板底部，隨后把培養(yǎng)板放在37℃，5%CO2恒溫孵育箱中1.5～2.5 h。1.5～2.5 h后取出在超凈操作臺(tái)上用加液器緩慢小心分別加入DMEM低糖、DMEM高糖、DMEM/F12培養(yǎng)液（含1∶100的青霉素和鏈霉素）。倒置顯微鏡下觀察未見異常后置于37℃，5%CO2恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，孵育期間要更換培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞游出面積和細(xì)胞計(jì)數(shù)情況 在相同的培養(yǎng)條件下，采用足月、健康剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦的新鮮、無菌、健康的新生兒臍帶。以每厘米臍帶培養(yǎng)進(jìn)行比較計(jì)數(shù)，三種不同培養(yǎng)基細(xì)胞游出概率及細(xì)胞計(jì)數(shù)比較見表 1、2。

2.2 人臍帶MSCs形態(tài)學(xué)特性 人臍帶華通膠行組織塊貼壁法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，分別應(yīng)用A組、B組、C組進(jìn)行培養(yǎng)。觀察7 d、15 d細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：A組B組細(xì)胞游出時(shí)間偏長，數(shù)量較少，成功概率下降，鏡檢發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞游出少，瘦小，生長緩慢，呈索狀偏長，細(xì)胞排列稀疏；C組細(xì)胞游出時(shí)間較短，數(shù)量較多，大片呈集落群體生長，生長迅速，增殖較快，成功概率較高，鏡檢發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞游出較多，體積較大，呈條索狀或菱形偏長，形態(tài)均一，大多數(shù)平行生長，細(xì)胞融合及細(xì)胞排列緊密，多數(shù)可出現(xiàn)多層細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛［1，2］。

表1 不同培養(yǎng)基細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)游出面積百分比（%）

表2 不同培養(yǎng)基不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)（每厘米臍帶）

2.3 不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間段對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)的影響 通過三種不同培養(yǎng)基進(jìn)行原代干細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：在三種培養(yǎng)基中C組培養(yǎng)為最佳；B組次之，A組一般。

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果顯示，三種不同培養(yǎng)基及不同時(shí)間段比較，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果還顯示，P值（Sig）均＜0.05。

認(rèn)為DMEM低糖和DMEM高糖、DMEM高糖和DMEM/F12、DMEM/F12和DMEM低糖三組之間對(duì)比對(duì)細(xì)胞生長差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC－MSCs）起源于成體干細(xì)胞的中胚層，來源于臍帶的華爾通膠或叫沃頓膠（whartoncs jelly，WJ），是具有自我更新和多向分化的多能干細(xì)胞，參與神經(jīng)的修復(fù)，促進(jìn)多種有利因子的產(chǎn)生，在其組織內(nèi)可以進(jìn)行遷移、整合、調(diào)節(jié)、分泌等作用，在脊髓損傷的修復(fù)治療方面較其他干細(xì)胞治療更具有明顯優(yōu)勢(shì)［3－11］，成為目前干細(xì)胞研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。

臍帶處理要求清洗干凈，必須選擇足月剖腹產(chǎn)健康胎兒的新鮮臍帶，低溫保存4 h內(nèi)處理，時(shí)間越短越好，最好不要超過24 h；李鐸等［12］對(duì)臍帶進(jìn)行24 h內(nèi)處理，HUC－MSCs獲得量及分離成功率高，隨時(shí)間延長獲得量減少，分離成功率降低。竇慧慧［13］應(yīng)用MesencultTM培養(yǎng)基對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)成功率達(dá)到100%；但其價(jià)格較高，適于專業(yè)干細(xì)胞技術(shù)人員。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基的選擇十分重要［14－16］，對(duì)今后培養(yǎng)成功起著關(guān)鍵決定性作用；一般科研院校學(xué)生應(yīng)用DMEM/F12培養(yǎng)基已足夠，價(jià)格低，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠；應(yīng)用MesencultTM培養(yǎng)基價(jià)格太高。FBS濃度一般控制在10%～20%，該研究經(jīng)過多次濃度配比比較發(fā)現(xiàn)采用15%的培養(yǎng)基效果較好。個(gè)別干細(xì)胞需要更高濃度的培養(yǎng)基。A組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，行人臍帶華通膠原代培養(yǎng)時(shí)間一般情況下比同期干細(xì)胞培養(yǎng)延長3天，細(xì)胞生長緩慢，貼壁率低；B組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，行人臍帶華通膠原代培養(yǎng)一般情況下最早開始5 d就可見干細(xì)胞貼壁生長，10 d左右干細(xì)胞自組織塊游離出來越來越多，14 d開始貼壁生長逐漸旺盛，22 d左右細(xì)胞生長開始逐漸變得緩慢；C組加15%FBS加1%青鏈霉素雙抗，3 d就可見少量干細(xì)胞貼壁生長，5 d可見明顯生長，7 d左右干細(xì)胞自組織塊游離出來越來越多，14～22 d左右貼壁生長最為旺盛，比A組B組效果明顯。一般情況下17～20 d傳代最好，25 d左右貼壁細(xì)胞生長變慢，27 d基本停止生長或老化，最長培養(yǎng)35 d細(xì)胞貼壁生長未再見明顯變化。

通過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長形態(tài)有所不同，A組培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁細(xì)胞生長緩慢，排列稀疏，細(xì)胞干癟瘦小，整體體積小；B組培養(yǎng)的細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞體積變大，整體體積明顯增大，后期集落群體明顯細(xì)胞密集；C組培養(yǎng)細(xì)胞生長形態(tài)均一，胞體飽滿，細(xì)胞狀態(tài)及密集度更高，較前兩組效果更好；同時(shí)發(fā)現(xiàn)臍帶 MSCs 體外增殖較快較高等多種優(yōu)點(diǎn)［17，18］。

綜上所述，采用DMEM/F12培養(yǎng)基+15%FBS聯(lián)合培養(yǎng)所取得的原代干細(xì)胞形態(tài)均一，生長良好，質(zhì)量較高，成分較純，解決了原代細(xì)胞培養(yǎng)生長不良，游出率較低，細(xì)胞較少，成功率較低等難題，對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了有力依據(jù)，為提高實(shí)驗(yàn)研究和培養(yǎng)成功率奠定了良好基礎(chǔ)［19］。

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