馬慧鑫 王 磊 汪林慶 周 茜 陳松林

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；4. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州 350116)

L-精氨酸主要通過(guò)“精氨酸酶”途徑和“NO”途徑參與機(jī)體代謝過(guò)程。精氨酸酶(Arginase)催化L-精氨酸生成鳥(niǎo)氨酸和尿素，鳥(niǎo)氨酸是合成多胺類(lèi)物質(zhì)的前體，而多胺是重要的代謝調(diào)控物質(zhì)。一氧化氮合酶(NOS)分解 L-精氨酸生成瓜氨酸和一氧化氮(Munder et al,2009)。兩條途徑之間相互抑制，共同調(diào)節(jié)精氨酸的代謝。病理?xiàng)l件下，精氨酸酶和一氧化氮合酶的動(dòng)態(tài)平衡被打破，多胺、NO等產(chǎn)物含量發(fā)生變化，導(dǎo)致多種病理反應(yīng)和免疫失調(diào)(孫紅暖等, 2014; 王琦, 2015)。

巨噬細(xì)胞是脊椎動(dòng)物先天性免疫反應(yīng)和特異性免疫的主要執(zhí)行者，在免疫防御和組織修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。精氨酸酶是巨噬細(xì)胞極化的重要標(biāo)志，在替代激活型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，參與機(jī)體免疫反應(yīng)(Morris et al, 1998)。在炎癥發(fā)生過(guò)程中，活化的巨噬細(xì)胞能夠?qū)-精氨酸水解成L-鳥(niǎo)氨酸、NO和多種活性氮物質(zhì)，發(fā)揮抵御病毒、細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞等的作用(MacMicking et al, 1997)。精氨酸酶有Ⅰ和Ⅱ兩種亞型，二者具有相似的結(jié)構(gòu)特征和酶特性，區(qū)別在于各自的亞細(xì)胞定位、組織分布和免疫反應(yīng)不同(Jenkinson et al,1996)。目前，Arg-Ⅰ和 Arg-Ⅱ基因僅在大西洋鮭魚(yú)(Salmo salar)(Benedicenti et al, 2016)、香魚(yú)(Plecoglossus altivelis)(丁斐斐等, 2016)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Wright et al, 2004)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio L.)(Joerink,2006)等少數(shù)硬骨魚(yú)中被克隆和鑒定出來(lái)，推測(cè)精氨酸酶在魚(yú)類(lèi)抗菌免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。劉華等(2016)在牙鲆(Paralichthys olivaceus)中克隆得到了284 bp的中間片段，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，但沒(méi)有分析其與免疫的相關(guān)性。

牙鲆俗稱(chēng)牙片、偏口等，是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一(雷霽霖, 2011)，因其具有極好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值而受到大家的喜愛(ài)。但由于過(guò)度捕撈，野生牙鲆數(shù)量銳減。同時(shí)，工廠化養(yǎng)殖近親繁殖嚴(yán)重，使得種質(zhì)資源嚴(yán)重退化。傳染病造成的牙鲆大面積死亡現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成了巨大的損失(雷霽霖,2011; 莫照蘭等, 2003)。從魚(yú)類(lèi)自身的免疫調(diào)控入手，對(duì)其抗菌感染的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，挖掘抗病相關(guān)基因顯得尤為重要(陳松林等, 2016)。本研究對(duì)精氨酸酶Ⅱ(ArginaseⅡ, Arg-Ⅱ)進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆分析，檢測(cè)了 Arg-Ⅱ基因在正常組織和遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的不同組織和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平，為研究Arg-Ⅱ在魚(yú)類(lèi)免疫分子機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用牙鲆為健康2齡牙鲆，取自山東黃海水產(chǎn)有限公司，感染所用遲緩愛(ài)德華氏菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNAiso試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs和 SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司(日本)。引物合成及序列測(cè)定由睿博興科生物有限公司(北京)完成。

1.2 方法

l.2.1 組織樣品的采集 隨機(jī)選取9尾2齡牙鲆，分別取腸、脾、鰓、心、皮膚、腦、肌肉、肝臟、腎臟等組織，立即投到液氮中保存，隨后轉(zhuǎn)移到–70℃冰箱保存。參考鄭衛(wèi)衛(wèi)等(2016)的方法，取6個(gè)月牙鲆用于遲緩愛(ài)德華氏菌感染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組按照半致死濃度LD50為2.63×104CFU/ml的劑量進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組注射等量PBS溶液，分別在注射后0、6、12、24、48 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)樣本，分別取腎臟、鰓、脾臟和肝臟組織。體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)參考孫璐明等(2016)的方法，實(shí)驗(yàn)組按照感染復(fù)數(shù)20∶1接種到吞噬細(xì)胞中，對(duì)照組加入等量PBS溶液，在感染后0、4、8、12、24 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 牙鲆 Arg-Ⅱ的克隆及序列分析 通過(guò)生物信息學(xué)方法在牙鲆基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(Shao et al,2016)中篩選Arg-Ⅱ基因信息，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò) PCR擴(kuò)增中間序列，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。測(cè)序驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性。根據(jù)中間序列設(shè)計(jì)5-RACE擴(kuò)增引物 Arg-Ⅱ-5′N(xiāo)、Arg-Ⅱ-5′R 和 3-RACE 擴(kuò)增引物 Arg-Ⅱ-3′R、Arg-Ⅱ-3′N(xiāo) (表 1)，通過(guò) TaKaRa RACE 擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得 5′UTR和 3′UTR區(qū)域序列，測(cè)序驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性。序列分析使用DNAstar軟件和NCBI-CDD search網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)。

1.2.3 牙鲆 Arg-Ⅱ的組織表達(dá)特征 參考位戰(zhàn)飛等(2016)的方法，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Arg-Ⅱ基因在各個(gè)組織中的表達(dá)情況。對(duì)采集的正常牙鲆組織樣品分別進(jìn)行總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄。以β-actin為內(nèi)參，采取三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，最后72℃延伸30 s，同時(shí)采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)，之后加入熔解曲線(xiàn)程序。利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法2–ΔΔCT對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，分析Arg-Ⅱ基因在各個(gè)組織的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 遲緩愛(ài)德華氏菌感染對(duì)牙鲆免疫組織以及巨噬細(xì)胞Arg-Ⅱ mRNA表達(dá)的影響 對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌感染牙鲆的肝、脾、腎、鰓等免疫組織和體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，分別進(jìn)行總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Arg-Ⅱ mRNA的表達(dá)變化，方法同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用 SPSS 19.0.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異顯著。

表1 本研究用到的引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 牙鲆Arg-Ⅱ基因的序列分析

依據(jù)基因組和轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增及測(cè)序顯示，牙鲆Arg-Ⅱ基因由1882個(gè)核苷酸組成，包含一個(gè)1050 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼349個(gè)氨基酸。分子量預(yù)測(cè)為38.02 kDa，等電點(diǎn)為6.42。通過(guò) 5′RACE 和 3′RACE 向兩端擴(kuò)增，獲得 5′UTR 長(zhǎng)度為150 bp，3′UTR長(zhǎng)度為708 bp。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)牙鲆 Arg-Ⅱ基因編碼的氨基酸具有典型的 Arginase結(jié)構(gòu)特征，在氨基酸的第 22、26、104、108、153、333、349位存在7個(gè)糖基化位點(diǎn)(圖1)。氨基酸的多重比對(duì)結(jié)果顯示，牙鲆Arg-Ⅱ N端比ArgⅠ多120個(gè)氨基酸，C端相似性較高，推測(cè)二者具有不同的功能。牙鲆 Arg-Ⅱ與其他生物 Arg-Ⅱ具有多個(gè)保守氨基酸區(qū)段(圖2)。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，牙鲆與其他物種的Arg-Ⅱ氨基酸序列聚為一簇，相似性為 58%～93%。其中，和鱸魚(yú)(Lates calcarifer)Arg-Ⅱ基因的同源性最高，為93%。與兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)及哺乳動(dòng)物的Arg-Ⅱ的氨基酸序列的同源性不高，僅為 58%～69%。牙鲆 ArgⅠ與大鼠(Rattus norvegicus)和小鼠(Mus musculus)的ArgⅠ聚為一簇(圖3)。

圖1 牙鲆Arg-Ⅱ cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The Arg-Ⅱ cDNA sequence and deduced amino acids in P. olivaceus小寫(xiě)字母代表5′和3′端非編碼區(qū)；大寫(xiě)字母代表編碼區(qū)序列，上面為核苷酸序列，下面對(duì)應(yīng)為氨基酸序列；起始密碼子ATG、終止密碼子TGA、polyA尾均加下劃線(xiàn)；紅色大寫(xiě)字母代表磷酸化修飾位點(diǎn)；Lowercase letters represent the sequence of 5′ and 3′ unstranslated region, capital letters represent the coding sequence. The nucleotide sequence is above and the coded amino sequence is below. The initiation codon ATG, the stop codon TGA, and the polyadenylation are underlined; Red capitals represent phosphorylation sites

圖2 牙鲆與其他物種Arg-Ⅱ和Arg-Ⅰ氨基酸序列多重比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of Arg-Ⅱ and Arg-Ⅰ amino acid sequence between P. olivaceus and other speciesXP_019962845 Paralichthys olivaceus Arg-Ⅱ, XP_019965324 Paralichthys olivaceus Arg-Ⅰ, XP_018537157 Lates calcarifer Arg-Ⅱ, XP_010754895 Larimichthys crocea Arg-Ⅱ, XP_003445522 Oreochromis niloticus Arg-Ⅱ, XP_008311803 Cynoglossus semilaevis Arg-Ⅱ, XP_004082141 Oryzias latipes Arg-Ⅱ, XP_021441146 Oncorhynchus mykiss Arg-Ⅱ,AMJ39609 Plecoglossus altivelis Arg-Ⅱ, NP_955905 Danio rerio Arg-Ⅱ, CAI38847 Cyprinus carpio Arg-ⅡA, CAF02014 Cyprinus carpio Arg-ⅡB, CAI38846 Cyprinus carpio Arg-ⅡC, NP_001079511 Xenopus laevis Arg-Ⅱ, NP_001186633 Gallus gallus Arg-Ⅱ, DAA25083 Bos Taurus Arg-Ⅱ, NP_001163 Homo sapiens Arg-Ⅱ, AAA98611 Mus musculus Arg-Ⅰ, AAA40760 Rattus norvegicuss Arg-Ⅰ

2.2 健康牙鲆Arg-Ⅱ mRNA的組織表達(dá)特征

取健康牙鲆的肝、脾、腎、腦、鰓和腸組織進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。牙鲆 Arg-Ⅱ基因擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為111 bp，內(nèi)參β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為92 bp。結(jié)果顯示(圖4)，健康牙鲆Arg-Ⅱ mRNA主要在肝、腎、腸中高表達(dá)，其次是鰓、心、腦，在其他組織中微弱表達(dá)。

2.3 牙鲆 Arg-Ⅱ mRNA 的表達(dá)與遲緩愛(ài)德華氏菌感染的相關(guān)性

根據(jù)Arg-Ⅱ在健康牙鲆組織中的表達(dá)特征，選取遲緩愛(ài)德華氏菌感染牙鲆的肝、腎、鰓、脾組織、體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。圖5顯示，在牙鲆的腎組織中Arg-Ⅱ mRNA的相對(duì)表達(dá)量在感染后6 h開(kāi)始增加，12 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.98倍，24 h略有下降，48 h基本降至對(duì)照組；在鰓組織中，6 h和12 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組的1.53倍和2.1倍；在脾組織中，在6 h開(kāi)始增加，12 h和24 h顯著高于對(duì)照組，12 h時(shí)為對(duì)照組的5.23倍，48 h與對(duì)照組無(wú)顯著差異；肝組織中，Arg-Ⅱ的表達(dá)量在 6 h時(shí)顯著增加，為對(duì)照組的 3.8倍，12 h時(shí)略有下降，24 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平；巨噬細(xì)胞中，4 h開(kāi)始增加，8 h時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照組的6.1倍，24 h后恢復(fù)到對(duì)照組水平。

3 討論

本研究通過(guò)牙鲆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì) Arg-Ⅱ基因的特異性引物，獲得全長(zhǎng)cDNA序列。劉華等(2016)克隆得到的精氨酸酶片段為本研究克隆得到的精氨酸酶Ⅱ序列全長(zhǎng)的一部分。通過(guò)多重序列比對(duì)可知，牙鲆與哺乳動(dòng)物的 Arg-Ⅱ基因有更多的相似性，而Arg-Ⅱ是線(xiàn)粒體蛋白，需要N-末端線(xiàn)粒體靶向肽進(jìn)入線(xiàn)粒體基質(zhì)(Korte et al, 1997; Todgham et al, 2001)。作者推測(cè)，Arg-Ⅱ發(fā)揮免疫作用的主要信號(hào)通路可能有兩條：在甘氨酸鳥(niǎo)氨酸循環(huán)信號(hào)通路中，精氨酸可以在Arg-Ⅱ的作用下分解成尿素和鳥(niǎo)氨酸，鳥(niǎo)氨酸有利于細(xì)胞再生以及傷口的愈合，同時(shí)，鳥(niǎo)氨酸是合成多胺類(lèi)物質(zhì)的前體，多胺在生物學(xué)調(diào)控中發(fā)揮著巨大作用，調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能(Kepkalenhart et al, 2001)。在精氨酸循環(huán)信號(hào)通路中，iNOS可以長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生大量的NO，而過(guò)量的NO生成會(huì)引起腸黏膜和腸屏障功能損傷，對(duì)胃腸道的運(yùn)動(dòng)也有不利影響；同時(shí)，精氨酸由于NO的釋放不平衡也會(huì)造成全身炎癥反應(yīng)的加劇，在免疫反應(yīng)中，來(lái)源于精氨酸的NO起了主導(dǎo)作用。而Arg-Ⅱ與一氧化氮合酶(NOS)競(jìng)爭(zhēng)L-精氨酸，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能(Corraliza et al, 1995; 朱琳楠等,2010; 陶璇, 2012)。

圖3 基于Neighbor-Joining法構(gòu)建牙鲆及其他物種Arg-Ⅱ及Arg-Ⅰ氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Arg-Ⅱ and Arg-Ⅰ amino acid sequence of P. olivaceus and other species based on neighbor-joining

圖4 牙鲆Arg-Ⅱ mRNA的組織表達(dá)Fig.4 The tissue expression of Arg-Ⅱ mRNA in P. olivaceus1: 肌肉; 2: 皮膚; 3: 脾臟; 4: 心臟; 5: 腦; 6: 鰓; 7: 腸;8: 腎臟; 9: 肝臟。上標(biāo)字母為SPSS軟件中Duncan算法計(jì)算出的子集分組The letters above the columns were subsets by Duncan algorithm. 1: Muscle; 2: Skin; 3: Spleen; 4: Heart; 5: Brain; 6:Gill; 7: Intestine; 8: Kidney; 9: Liver

巨噬細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，分泌一系列促炎癥因子，M2型巨噬細(xì)胞分泌的精氨酸酶可以與iNOS競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合底物精氨酸，分解精氨酸為多胺，促進(jìn)細(xì)胞分裂和膠原的形成，對(duì)炎癥后期由病原微生物造成的組織損傷進(jìn)行修復(fù)和重塑，在機(jī)體抵御細(xì)胞內(nèi)病原體的感染中起到重要作用(Mantovani et al, 2002; Gordon et al, 2003)。已有研究顯示，精氨酸酶I具有免疫抑制功能，特別是對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的抑制，但對(duì)Arg-Ⅱ的研究還鮮有報(bào)道(Ckless et al,2008; 張乃春等, 2015)。本研究中，Arg-Ⅱ在遲緩愛(ài)德華氏菌感染巨噬細(xì)胞后顯著上調(diào)，推測(cè)與上述2條免疫通路有關(guān)，通過(guò)上調(diào)Arg-Ⅱ基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。

組織分布表明，Arg-Ⅱ在各個(gè)組織中都有表達(dá)，尤其是在肝臟等組織中表達(dá)最高，這與鯉魚(yú)、虹鱒中的研究結(jié)果較一致(Wright et al, 2004; Joerink et al,2006)。Marathe等(2006)研究表明，Arg-Ⅱ直接調(diào)控肝受體X(LRX)，而LRX能抑制iNOS在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，提高免疫效果。與哺乳動(dòng)物相比，魚(yú)類(lèi)的Arg-Ⅱ基因免疫方面的研究相對(duì)較少，在已有的研究中，揭示了Arg-Ⅱ基因可能與魚(yú)類(lèi)免疫有關(guān)。在鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染的香魚(yú)中，香魚(yú)肝組織中 Arg-Ⅱ基因 4 h之后開(kāi)始增加，8 h之后為對(duì)照組的 5.2倍(Benedicenti et al, 2016)。在阿米巴變形蟲(chóng)感染的大馬哈魚(yú)(Oncorhynchus keta)組織中，脾臟的表達(dá)量為對(duì)照組的2.75倍(Morris et al, 1998)。本研究中，遲緩愛(ài)德華氏菌注射牙鲆，免疫相關(guān)組織(如肝臟、腎臟等)中Arg-Ⅱ mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致。同時(shí)，腎、鰓等免疫組織以及巨噬細(xì)胞中Arg-Ⅱ mRNA的表達(dá)量也明顯上調(diào)，揭示了 Arg-Ⅱ可能與牙鲆免疫應(yīng)答密切相關(guān)，可能通過(guò)巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深究。

圖5 遲緩愛(ài)德華氏菌感染對(duì)牙鲆重要組織及細(xì)胞的Arg-Ⅱ mRNA表達(dá)的影響Fig.5 mRNA expressions of Arg-Ⅱ in differernt tissues of P. olivaceus infected with E. tardaA: 腎; B: 鰓; C: 脾臟; D: 肝臟: E: 吞噬細(xì)胞。感染組與對(duì)照組之間的差異顯著性(*: P＜0.05; **: P＜0.01)A: Kidney; B: Gill; C: Spleen; D: Liver: E: Phagocytes. Difference between the treatment and control group (*: P＜0.05; **: P＜0.01)

4 結(jié)論

牙鲆 Arg-Ⅱ基因 cDNA序列與鱸魚(yú) Arg-Ⅱ序列最相似。健康牙鲆中，Arg-Ⅱ基因主要在肝、腎、腸中表達(dá)；遲緩愛(ài)德華氏菌感染后，Arg-Ⅱ基因表達(dá)量顯著上調(diào)，揭示了Arg-Ⅱ與牙鲆抗病原感染的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

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