用SOS/umu試驗評價降雨徑流遺傳毒性的變化

高晶，張肖，趙樂軍，宋現(xiàn)才，金星龍, *

1. 天津理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，天津 300384 2. 天津市市政工程設(shè)計研究院，天津 300392

隨著人口的快速增長和城市擴張，城市水資源需求量逐年增大，水資源短缺和水污染日益嚴(yán)重，導(dǎo)致城市水資源壓力加劇。近年來，海綿城市研究和建設(shè)使得降雨徑流受到廣泛關(guān)注，并且一些城市已將其作為灌溉和非飲用水水源[1]。但值得注意的是，降雨徑流中污染物通過地表徑流進(jìn)入城市受納水體，通過物理、化學(xué)和生物作用進(jìn)入水生生物和底棲動物體內(nèi)，通過食物鏈發(fā)生富集和生物放大作用，對水生生物和人類的健康構(gòu)成潛在的威脅[2]。因此，在雨水收集利用中，檢測雨水的污染物毒性是確保雨水安全利用的重要手段之一。

城市徑流中的污染物毒性效應(yīng)及其潛在的生態(tài)影響的研究尚處于起步階段。澳大利亞現(xiàn)有的雨水回收指南只包含一些收集和回收的常規(guī)水質(zhì)參數(shù)的數(shù)據(jù)[3]。而且，雨水的收集研究主要集中在病原體的判斷上，而忽略對有毒的化學(xué)物質(zhì)的判斷。即使關(guān)注化學(xué)物質(zhì)，大多數(shù)研究也集中在優(yōu)先污染物[4]。近年來，我國也開展降雨徑流毒性的研究，張莉莉等[2]對降雨徑流的毒性、評價方法及評價鑒定進(jìn)行了綜述，但主要是針對急性毒性的方法介紹，對遺傳毒性的研究較少。

SOS/umu試驗利用可致DNA受損的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生SOS反應(yīng)并產(chǎn)生β-半乳糖苷酶基因與UmuC基因相融合，根據(jù)細(xì)菌生成的β-半乳糖苷酶的數(shù)量，即可判斷DNA受損的程度[5]。目前SOS/umu已廣泛用于測試飲用水消毒副產(chǎn)物、自然水[6]和污水處理廠出水[7]的遺傳毒性效應(yīng)。因而采用遺傳毒性研究雨水徑流過程中的生物毒性，對雨水的回收利用有重要的意義。本文通過SOS/umu試驗對不同下墊面降雨過程中不同時間段的雨水樣品進(jìn)行遺傳毒性測試，分析降雨過程生物毒性的變化趨勢，直觀評價降雨徑流的生物安全性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

試驗菌種為鼠傷寒沙門式菌(Salmonellatyphimurium)TA1535/PSK1002菌株，將已滅菌的20%丙三醇溶液與菌液以1:1的體積比混合，分別裝到1.5 mL的凍存離心管中，每個離心管存放1.0 mL的菌種，放置在-80 ℃冰箱中保存一年。

試驗所用主要儀器：水浴振蕩器(SHA-C，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、微孔板恒溫振蕩器(HWF200，南京互川電子有限公司)、高壓滅菌鍋(DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械廠)、紫外可見分光光度計(Cary50，美國瓦立安中國有限公司)等。主要試劑：二甲基亞砜(DMSO， ACS級，美國AMERSCO)，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO，分析純，上海麥克林)，二氯甲烷、甲醇、正己烷(美國BCL， 均為HPLC級)，β-半乳糖苷酶(ONPG，分析純，北京Solarbio)等。

1.2 樣品采集與前處理

2017-05—2017-06期間共采集2場降雨，2場降雨時間均為4 h，降雨強度均為中雨。5月份降雨量為9.8 mm，屋面和道路采集的樣品數(shù)分別為9和3；6月份降雨量為38.6 mm，屋面和道路采集的樣品數(shù)分別為9和6。采樣方法參照《大氣降水樣品的采集與保存》(GB13580.2—92)進(jìn)行，采樣瓶使用前經(jīng)過5%硝酸浸泡、自來水沖洗、蒸餾水潤洗，分別在屋面的落水管和道路的排水口處進(jìn)行雨水樣品收集。

降雨初期30 min內(nèi)，每隔10 min采集一次；30～60 min內(nèi)，每隔15 min采集一次；60～120 min內(nèi)，每隔30 min采集一次；2 h以后每隔1 h采集一次直至降雨結(jié)束[8-10]，每次收集4 L雨水樣品，立即運回實驗室。分別用濾紙和玻璃纖維濾膜過濾(GF/F 47 mm，Whatman公司)，然后用OASIS HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL，Waters公司)進(jìn)行富集，萃取柱事先用甲醇、稀鹽酸和超純水活化。富集結(jié)束后，萃取柱分別用10 mL甲醇和15 mL正己烷和二氯甲烷(體積比1:2)進(jìn)行洗脫并在氮吹儀下吹干至0.9 mL，再用氮氣流吹干，用200 μL DMSO定容，-20 ℃保存。

1.3 SOS/umu試驗

從-80 ℃冰箱取出菌種，用TGA培養(yǎng)基復(fù)蘇，37 ℃隔夜振蕩培養(yǎng)12 h后在無菌操作臺進(jìn)行轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，然后測菌液在595 nm處時吸光度為0.7～0.8。96孔板A中按照不同濃度設(shè)置水樣、陰性對照(DMSO稀釋液)、陽性對照(4-NQO)和空白對照，每組3個平行樣，振蕩培養(yǎng)2 h后轉(zhuǎn)移到提前加入135 μL的培養(yǎng)基B板，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。B板培養(yǎng)期間準(zhǔn)備C板，每孔加入120 μL B-buffer，并配制鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)溶液，避光振搖2 h，B板結(jié)束后放入冰箱10 min用酶標(biāo)儀測定OD595，然后從B板每孔吸取30 μL到C板相應(yīng)位置，并立即加入30 μL ONPG溶液混合振蕩30 min，結(jié)束后加入反應(yīng)終止液120 μL的Na2CO3，放入冰箱10 min用酶標(biāo)儀測定OD415。

1.4 數(shù)據(jù)處理與計算

SOS/umu測試結(jié)果的計算方法參見文獻(xiàn)[11]：

(1)

(2)

式中，G為生長因子，G大于0.5的數(shù)據(jù)可用于計算IR；IR為誘導(dǎo)率，IR>2可判斷為致突變陽性結(jié)果；A595T、A595B、A595N、A415T、A415B、A415N分別為待測樣品、空白對照、陰性對照在595 nm和415 nm處的吸光度。測試標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的陽性參照物系列后，以陽性參照物4-NQO的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，誘導(dǎo)率IR為縱坐標(biāo)繪制劑量-效應(yīng)曲線，得其方程為y=0.10944x+1(R2=0.9946)。相同實驗條件下測試雨水樣品，繪制水樣的劑量-效應(yīng)曲線，利用2個劑量-效應(yīng)曲線線性擬合斜率的比值，將雨水樣品毒性以4-NQO當(dāng)量濃度表示，單位為ng·L-1。

2 結(jié)果(Results)

圖1展示了5月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化。從圖1(A)中可知，屋面降雨徑流水樣劑量-效應(yīng)線性擬合斜率隨采樣時間呈降低趨勢。由圖1(B)可知，降雨初期30 min內(nèi)雨水樣品的TEQ4-NQO分別是160 ng·L-1、269 ng·L-1和267 ng·L-1，在10～20 min內(nèi)達(dá)到最大，在經(jīng)過降雨初期后，遺傳毒性大幅度下降，30～45 min內(nèi)達(dá)到189 ng·L-1。隨著降雨時間的增加，降雨持續(xù)45 min時屋面的大部分污染物已經(jīng)被沖刷，遺傳毒性也隨之逐漸降低，直至降雨結(jié)束達(dá)到21 ng·L-1。這表明雨水樣品中的污染物主要來源于下墊面，其大部分污染物主要被初期雨水沖刷，導(dǎo)致初期雨水樣品毒性較大，說明雨水樣品毒性受到屋面污染物影響較大。

圖1 5月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化注：A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當(dāng)量濃度變化。Fig. 1 Genetic toxicity testing of roof rainfall runoff at different sampling times on MayNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

圖2 5月份不同采樣時間道路降雨徑流的遺傳毒性變化注：A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當(dāng)量濃度變化。Fig. 2 Genetic toxicity testing of road rainfall runoff at different sampling times on MayNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

5月份道路各采樣時間段降雨徑流的毒性變化如圖2所示。從圖2(A)中可以看出，在道路降雨徑流產(chǎn)生的0.5 h內(nèi)，水樣劑量-效應(yīng)線性擬合斜率先增大后減小。由圖2(B)中可知，TEQ4-NQO先增加后減少，在前20 min內(nèi)從40.1 ng·L-1大幅升高到177.6 ng·L-1，20～30 min時間段內(nèi)從177.6 ng·L-1降為142.1 ng·L-1。圖2與圖1比較得出，5月份道路雨水樣品的遺傳毒性低于屋面雨水樣品的遺傳毒性。

圖3展示了6月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化。圖3(A)為6月份屋面降雨徑流中各時間段雨水樣品的遺傳毒性劑量-效應(yīng)曲線。從圖中可知，在每個時間段內(nèi)隨著雨水樣品含量的增加，水樣劑量-效應(yīng)線性擬合斜率逐漸增大。但隨著降雨徑流時間的持續(xù)，擬合斜率先增大后減小，降雨初期20 min達(dá)到最大。與5月份雨水樣品毒性數(shù)據(jù)相比較小，推測可能是由于6月降雨量大，降雨之間的時間間隔較短，污染物的累積量也呈減少趨勢。由圖3(B)與圖1(B)比較，可以得出2場降雨有相似的變化趨勢，在降雨初期30 min內(nèi)達(dá)到最大，隨之逐漸降低，但6月份該場降雨在120 min時降雨強度瞬間增大，導(dǎo)致該時間段雨水樣品的遺傳毒性出現(xiàn)小幅度上升，但仍低于初期雨水樣品的毒性，分別為55.0 ng·L-1(120～180 min)、64.7 ng·L-1(180～240 min)。

圖3 6月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化注: A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當(dāng)量濃度變化。Fig. 3 Genetic toxicity testing of roof rainfall runoff at different sampling times on JuneNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

圖4 6月份不同采樣時間道路降雨徑流的遺傳毒性變化注：A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當(dāng)量濃度變化。Fig. 4 Genetic toxicity testing of road rainfall runoff at different sampling times on JuneNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

6月份道路各采樣時間段降雨徑流的毒性變化如圖4所示，從圖4(A)可知，在10～20 min內(nèi)雨水樣品劑量-效應(yīng)線性擬合斜率最大，然后隨著降雨時間的增加而逐漸減小。圖4(B)也呈相似變化趨勢，在前20 min內(nèi)從121.0 ng·L-1升高到391.3 ng·L-1。

圖5 屋面不同采樣時間段遺傳毒性效應(yīng)曲線Fig. 5 Dose-effect curve of roof runoff of different sampling period

圖6 道路不同采樣時間段遺傳毒性效應(yīng)曲線Fig. 6 Dose-effect curve of road runoff of different sampling period

隨著降雨時間的持續(xù)，降雨強度逐漸減小，TEQ4-NQO也逐漸降低至89.0 ng·L-1。

3 討論(Discussion)

圖5和圖6為屋面和道路降雨過程中遺傳毒性當(dāng)量濃度的變化趨勢，由于路面從開始降雨至產(chǎn)生徑流需要一定的時間，所以采集樣品的數(shù)量存在差異。由圖中可知：屋面和道路2個下墊面在不同的降雨時期的同一時間段10～20 min 內(nèi)TEQ4-NQO達(dá)到峰值，之后有持續(xù)下降的趨勢，反映出下墊面對降雨徑流水質(zhì)的影響在初始沖刷現(xiàn)象最明顯，初期雨水毒性最大。對比2圖可得出：6月份道路雨水樣品的遺傳毒性大于5月份道路雨水樣品的毒性，但是屋面相反，可能是5月份距上次降雨時間間隔大約2個月，屋面污染物聚集多，所以毒性較大；而道路由于定期清掃，受降雨時間間隔和季節(jié)影響不大，因而推測是由于5、6月之間道路進(jìn)行翻新、溫度升高以及雨水的沖刷作用，導(dǎo)致污染物濃度增大進(jìn)而雨水樣品的毒性增大。

致謝：感謝中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心魏東斌研究員提供試驗菌株。

通訊作者簡介：金星龍，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為水污染控制及資源化，發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇。

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