徐誼 唐詩聰 周鑫 徐祥 黃耀元 王守峰 潘泓

人源性肺癌組織移植瘤模型是目前常用的移植瘤模型，該模型的移植瘤與原發(fā)腫瘤在組織學形態(tài)、免疫組織化學以及基因表型上可保持一致，可高度模擬人體內(nèi)環(huán)境，有利于研究腫瘤與間質(zhì)的相互作用、篩選新型的腫瘤治療藥物及藥物療效評價，為肺癌患者提供個體化治療［1］。但目前非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）人源性移植瘤（patientderived xenografts，PDX）模型成瘤率較低，成本較高，每個樣本需移植大量受體鼠，且制備時間長，需觀察2～16個月才能判斷模型是否成功［2］。本研究探討NSCLC組織在裸鼠皮下PDX模型的成瘤性，并分析其與原發(fā)腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，以期在構(gòu)建NSCLC PDX模型前或構(gòu)建模型過程中篩選合適的癌組織，提高成瘤率。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 NSCLC組織標本 隨機選取廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外科2016年7月至2017年1月經(jīng)手術(shù)切除的15例原發(fā)性NSCLC組織，均為初診且經(jīng)病理學檢查明確診斷，術(shù)前未行放化療，其中腺癌7例、鱗癌6例、大細胞癌2例；低分化6例、中分化6例、高分化3例。所有組織標本均在手術(shù)中無菌獲取。本研究獲廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 實驗動物和試劑 裸鼠購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，4～6周齡，體重 18～22 g，在SPF級條件下飼養(yǎng)。實驗所需HBSS緩沖液和胎牛血清購自Invitrogen公司，人源和鼠源目的基因引物及人源、鼠源β-actin內(nèi)參均購自廣西科迪試劑公司。鼠抗人Ki-67、p63、細胞角蛋白 5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyoid transcription factor-1，TTF-1）即用型單克隆抗體（一抗）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（二抗）、SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCLC PDX模型的建立 本課題組前期研究已成功構(gòu)建NSCLC PDX模型，具體實驗步驟見前期報道［3-4］。同時收集15例移植瘤模型對應患者的年齡、性別等一般情況以及原發(fā)腫瘤的病理類型、分化程度、TNM分期等臨床病理資料。

1.2.2 免疫組織化學法檢測TTF-1、p63、CK5/6、Ki-67蛋白的表達 NSCLC PDX模型對應的NSCLC患者原發(fā)腫瘤組織以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別進行常規(guī)HE染色和免疫組織化學法染色。免疫組織化學法染色采用SP兩步法：切片脫蠟至水；高壓熱修復，自然冷卻；置于3%H2O2溶液10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS清洗2 min×3次，分別滴加鼠抗人Ki-67、p63、CK5/6和TTF-1單克隆抗體，置于4℃冰箱過夜；PBS清洗2 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG，37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng) 20 min；PBS清洗 2 min×3次，DAB 顯色；蒸餾水沖洗，蘇木精對比染色細胞核，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照為已知陽性的標本。

1.2.3 結(jié)果判定 TTF-1、Ki-67和p63蛋白均定位于細胞核，CK5/6定位于細胞質(zhì)，陽性染色均呈（棕）黃色顆粒。免疫組織化學法染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片，定性分析患者腫瘤組織中TTF-1、Ki-67、p63和CK5/6的表達情況。以腫瘤細胞增殖最旺盛的5個高倍視野（×400）計數(shù)陽性細胞百分比。當腫瘤細胞陽性表達小于10%且沒有局灶區(qū)域呈陽性表達時記為陰性；腫瘤細胞陽性表達大于10%記為陽性；細胞幾乎全部表達陰性但局灶區(qū)域呈強陽性表達記為局灶陽性，局灶陽性亦歸為陽性［5］。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用獨立樣本t檢驗比較成瘤組和未成瘤組所對應腫瘤組織患者的年齡、腫瘤大小等；采用fisher確切概率法比較兩組腫瘤組織的分化程度、TNM分期和Ki-67、TTF-1、p63、CK5/6表達率。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC PDX模型成瘤性與對應患者臨床病理特征的關(guān)系

15例NSCLC組織在裸鼠皮下移植后成瘤6例，成瘤率為40%。分析成瘤性與對應患者主要臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，NSCLC PDX模型成瘤性與對應患者的TNM分期和腫瘤分化程度相關(guān)（P＜0.05），但與患者年齡、性別、吸煙情況、腫瘤大小以及組織學類型等無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.2 NSCLC PDX模型對應NSCLC組織中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表達

對應NSCLC組織的HE及免疫組化染色結(jié)果（圖1）顯示，TTF-1蛋白定位于細胞核，陽性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組TTF-1蛋白陽性表達率高于未成瘤組（83%vs 22%，P=0.041）；p63蛋白定位于細胞核，陽性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組中p63蛋白陽性表達率低于未成瘤組（50%vs 100%，P=0.041）；CK5/6定位于細胞質(zhì)，陽性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組中CK5/6蛋白陽性表達率與未成瘤組差異無統(tǒng)計學意義（33%vs 44%，P=0.315）；Ki-67蛋白定位于細胞核，陽性染色呈（棕）黃色顆粒，成瘤組中Ki-67蛋白陽性表達率高于未成瘤組（100%vs 22%，P=0.007），見表2。

表1 NSCLC PDX模型成瘤性與對應患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

表2 NSCLC PDX模型對應NSCLC組織中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表達［n（%）］

圖1 對應NSCLC組織中p63、TTF-1、CK5/6和Ki-67蛋白的表達（HE 染色，×400）

3 討論

肺癌裸鼠移植瘤模型的原位移植及腎包膜下移植均有較高的成瘤率，但這兩種方法均需熟練操作，且肉眼難以直視觀察成瘤情況，不利于推廣［3，6］。本研究采用的裸鼠皮下移植成瘤是目前常用的建模方法，成瘤率為20%～40%。本課題組前期研究［3-4］已證明，采用此方法建立的移植瘤模型在生物學特性上可與原腫瘤保持一致性。Perez-Soler等［7］將100例肺癌組織接種于裸鼠皮下，建模成功率為34%。Fichtner等［8］將102例肺癌組織接種于NOD/SCID祼鼠皮下，建模成功率為24.5%。本研究15例NSCLC組織在裸鼠皮下移植后成瘤6例，成瘤率為40%，與上述報道的成瘤率相當，提示采用此法建模正確，成功率較高。

文獻報道，NSCLC組織在裸鼠皮下成瘤性與原發(fā)腫瘤自身侵襲性和惡性程度相關(guān)，且移植成瘤對應的患者易復發(fā)，預后較差［9］。本研究比較成瘤組與未成瘤組對應患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)分期較高及腫瘤分化程度較低的NSCLC組織更易成瘤，提示NSCLC PDX模型成瘤率可能與原發(fā)腫瘤的侵襲性及惡性程度相關(guān)。

TTF-1又稱甲狀腺特異性增強子結(jié)合蛋白，是一種在甲狀腺、肺和間腦早期發(fā)育過程中表達的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種基因表達，亦是評價NSCLC侵襲性的有效指標［10］。Ki-67作為標記細胞增殖狀態(tài)的抗原，近年已廣泛用于腫瘤細胞增殖活性研究，與其他標記細胞增殖活性的方法相比，標記Ki-67抗原更簡單、可靠和準確。羅朋等［11］研究發(fā)現(xiàn)Ki-67高表達的腫瘤組織易移植成瘤。p63常表達于上皮組織基底層，在正常上皮組織的形成中發(fā)揮重要作用。p63基因在結(jié)構(gòu)上與p53基因具有高度同源性，是p53基因家族的一員。研究發(fā)現(xiàn)p63表達與肺癌侵襲性和轉(zhuǎn)移性等生物學特性相關(guān)［12］。本研究探討NSCLC PDX模型成瘤性與對應來源NSCLC癌組織中TTF-1、p63、CK5/6、Ki-67蛋白表達的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)成瘤組TTF-1和Ki-67蛋白表達水平明顯高于未成瘤組，推測TTF-1、Ki-67可能是原癌基因，通過調(diào)節(jié)TTF-1、Ki-67表達促進NSCLC細胞增殖、侵襲，從而更易在裸鼠體內(nèi)成瘤。然而p63表達水平明顯低于未成瘤組，提示p63可能是抑癌基因，其低表達可能與NSCLC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但具體機制尚未清楚。研究發(fā)現(xiàn)CK5/6陽性表達在腫瘤體積更大或鄰近組織受累范圍更大時顯著升高，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越高陽性表達越低，認為CK5/6可能與腫瘤生長、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。但本研究未發(fā)現(xiàn)成瘤組和未成瘤組CK5/6表達的差異性，可能與樣本量不足有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)分期較高和腫瘤分化程度較低的NSCLC組織在裸鼠皮下更易成瘤。因此，在構(gòu)建PDX模型前或構(gòu)建過程中，應綜合原發(fā)腫瘤分期、分化程度及TTF-1、Ki-67、p63的表達情況，篩選合適的NSCLC組織，以提高成瘤率。但本研究樣本量較小，有關(guān)結(jié)論仍待進一步證實。

［1］ TentlerJJ，Tan AC，WeekesCD，etal.Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development［J］.Nat Rev Clin Oncol，2012，9（6）：338-350.

［2］ Williams SA，Anderson WC，Santaguida MT，et al.Patient-derived xenografts，the cancer stem cell paradigm，and cancer pathobiology in the 21st century［J］.Lab Invest，2013，93（9）：970-982.

［3］ 潘泓，馬志清，毛力.裸鼠皮下及腎被膜下建立人肺癌裸鼠移植瘤模型的初步探索［J］.中華腫瘤雜志，2014，36（8）：571-574.

［4］ 唐詩聰，潘泓，黃耀元，等.人非小細胞肺癌裸鼠移植瘤模型的建立［J］.昆明醫(yī)科大學學報，2017，38（2）：28-32.

［5］ Mukhopadhyay S，Katzenstein AL.Subclassification of non-small cell lung carcinomas lacking morphologic differentiation on biopsy specimens：Utility of an immunohistochemical panel containing TTF-1，napsin A，p63，and CK5/6［J］.AmJ Surg Pathol，2011，35（1）：15-25.

［6］ Hoffman RM.Patient-derived orthotopic xenografts：better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts［J］.Nat Rev Cancer，2015，15（8）：451-452.

［7］ Perez-Soler R，Kemp B，Wu QP，et al.Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice［J］.Clin Cancer Res，2000，6（12）：4932-4938.

［8］ Fichtner I，Rolff J，Soong R，et al.Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers［J］.Clin Cancer Res，2008，14（20）：6456-6468.

［9］ John T，Kohler D，Pintilie M，et al.The ability to form primary tumor xenografts is predictive of increased risk of disease recurrence in early-stage non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2011，17（1）：134-141.

［10］Liu Y，Zhang G，Li H，et al.Serum microRNA-365 in combination with its target gene TTF-1 as a non-invasive prognostic marker for non-small cell lung cancer［J］.Biomed Pharmacother，2015，75：185-190.

［11］羅朋，章菊，李明，等.人肺鱗癌組織在裸鼠體內(nèi)的移植成瘤性與其 Ki-67 表達水平的關(guān)系［J］.腫瘤，2014，34（10）：913-918.

［12］ Ma Y，F(xiàn)an M，Dai L，et al.Expression of p63 and CK5/6 in earlystage lung squamous cell carcinoma is not only an early diagnostic indicator but also correlates with a good prognosis［J］.Thorac Cancer，2015，6（3）：288-295.