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      遷徙生長現(xiàn)象在變形桿菌檢測中的應(yīng)用

      2018-06-20 06:23:58陳冠武王鳳軍周廣彪許如蘇蘇建暉張崢嶸陳冬娥
      關(guān)鍵詞:斜面克氏菌株

      陳冠武 蔡 穎* 王鳳軍 周廣彪 許如蘇 蘇建暉 張崢嶸 陳冬娥

      (1.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515000;2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

      1 前言

      變形桿菌屬(Proteus)細(xì)菌包括5個(gè)種:普通變形桿菌(P.vulgaris)、奇異變形菌(P.mirabilis)、潘氏變形桿菌(P.pennea)、產(chǎn)粘液變形桿菌(P.myxofaciens)和 P.hauseri[1]。 美國藥典(USP<1111>)、歐洲藥典(EP 5.1.4)對變形桿菌屬有明確的檢測要求,我國CHINET監(jiān)測(中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測)也將變形桿菌屬列為監(jiān)測菌類之一。變形桿菌還是引起食源性疾病的重要病原之一[2]?!斑w徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌在合適條件下固有的生長特性,無論在國內(nèi)外微生物學(xué)經(jīng)典論著[1,3-4],還是在文獻(xiàn)上[5-8]都有明確的描述,而該屬細(xì)菌也因此而命名。但經(jīng)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)檢索,尚未發(fā)現(xiàn)將“遷徙生長現(xiàn)象”應(yīng)用于變形桿菌屬檢測鑒定的文獻(xiàn)和技術(shù)規(guī)范,可能的原因是在通常的培養(yǎng)條件下,這種特性并非能夠一直表現(xiàn)得那么穩(wěn)定和典型。筆者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)積累,并通過摸索,創(chuàng)新性地開發(fā)了 “克氏雙糖鐵長斜面遷徙生長試驗(yàn)”,能使變形桿菌的“遷徙生長現(xiàn)象”特性穩(wěn)定、典型表現(xiàn),而且易于判斷。筆者采用多種細(xì)菌菌株、人工染菌模擬樣品等,驗(yàn)證了該方法能夠有效地應(yīng)用于變形桿菌的初篩檢驗(yàn)。

      2 材料與方案

      2.1 試驗(yàn)材料

      本研究共選用了96株實(shí)驗(yàn)用菌,包括60株變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株和36株非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株,其中,有購自ATCC(美國菌種保藏中心)、CMCC(中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)、CICC(工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)、AS(中國普通微生物菌種保藏中心)菌種保藏中心的標(biāo)準(zhǔn)菌株,有汕頭檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室日常檢驗(yàn)分離鑒定的參考菌株和其他實(shí)驗(yàn)室提供(經(jīng)鑒定)的參考菌株。變形桿菌屬實(shí)驗(yàn)用菌編號在文中以“P+數(shù)字”表示代號,具體見表1;非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株主要選擇生化上與變形桿菌屬較為“近親”、或環(huán)境中常見菌種,以“N+數(shù)字”表示代號,具體見表2。

      表2 36株非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株清單

      2.2 主要設(shè)備與儀器、試劑

      SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司),CLASSⅡA/B3型生物安全柜(美國FORMA公司),HV-85型自動(dòng)高壓滅菌器 (日本HIRAYAMA公司),細(xì)菌菌濁儀和VITEK 2 Compact微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)等。

      克氏雙糖鐵干粉培養(yǎng)基(同時(shí)選用了3個(gè)廠家:北京陸橋技術(shù)有限公司、廣東環(huán)凱科技有限公司、青島日水生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品;制成克氏雙糖鐵長斜面,在下文簡稱北克、廣克、青克)、腦心浸液干粉培養(yǎng)基(BAI)、麥康凱培養(yǎng)基(MAC)、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基(下文簡稱桿顯)、營養(yǎng)瓊脂(NA)、血平板等均購自廣東環(huán)凱科技有限公司,API 20E生化試劑盒、氧化酶試劑、革蘭氏染色液均購自法國生物梅里埃公司,無抑菌劑、無表面活性劑化妝品基礎(chǔ)膏(下文簡稱基質(zhì))購自廣東金奇日化有限公司。

      3 實(shí)驗(yàn)方法

      3.1 實(shí)驗(yàn)菌株的遷徙生長試驗(yàn)

      (1)按標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28的要求配制克氏雙糖鐵長斜面培養(yǎng)基(底層高度約2cm、斜面長度約6cm),在2周時(shí)間內(nèi)使用。3個(gè)廠家的干粉培養(yǎng)基按配制比例制成的斜面(北克、廣克、青克)后,在斜面的底部與試管壁之間都有約100 μL冷凝液,通常放置4℃冰箱4周內(nèi)不會(huì)完全變干。

      (2)所有實(shí)驗(yàn)菌株均從磁珠凍存管各取1顆放入10 mL BAI中、置于 36±1℃復(fù)蘇增菌約 18 h,肉湯濁度均達(dá)2。

      (3)用移液槍分別吸各菌種500 μL菌液,小心地將吸管伸入到斜面底部冷凝液中輕輕接入菌液,操作時(shí)移液槍吸頭不能碰到培養(yǎng)基,3個(gè)廠家的克氏雙糖鐵長斜面同時(shí)接種操作。置于36±1℃、培養(yǎng)24 h和 48 h。

      (4)斜面菌苔的驗(yàn)證:分別用接種環(huán)在所有實(shí)驗(yàn)菌株的克氏雙糖鐵斜面頂往下≤1 cm位置斜面的表面做向上刮取動(dòng)作2次,分別劃線接種于血平板,置于36±1℃培養(yǎng)24 h和48 h。

      3.2 遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)

      選擇 P1、P3、P5、P7 4 株普通變形桿菌;P8、P9 2 株潘氏變形桿菌;P10、P21、P27、P28、P29、P31 6株奇異變形桿菌共12株作為代表菌株,做遷徙生長鑒定法的靈敏度試驗(yàn)。

      分別挑取上述12株代表菌的菌苔,各制出1.0麥?zhǔn)隙鹊木鷿嵋?,然后?0倍數(shù)稀釋,分別取10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液進(jìn)行檢測。按2.1的方法操作,置于36±1℃培養(yǎng)24 h。上述操作的同時(shí),各菌株稀釋液按吸取量500 μL菌液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

      3.3 人工染菌模擬化妝品樣品試驗(yàn)

      3.3.1 檢測樣制作

      選部分代表性實(shí)驗(yàn)菌菌苔調(diào)制成1.0麥?zhǔn)隙染?,參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[9]的增菌方法,以“無表面活性劑化妝品基礎(chǔ)膏(基質(zhì)液)0.5 g+干擾菌N 各 50 μL+變形桿菌 P 50 μL+SCDLP 4.5 mL”混合均勻,制出若干檢測模擬化妝品樣品增菌液(詳見表3),按2.1在3種培養(yǎng)基(北克、廣克、青克)上進(jìn)行遷徙生長試驗(yàn)。

      表3 人工染菌模擬化妝品樣品配方列表

      3.3.2 斜面菌苔的驗(yàn)證

      按2.1的方法,分別將菌苔醮取物劃線接種于MAC、桿顯平板,36±1℃培養(yǎng)24 h后觀察平板上菌落特點(diǎn)。

      4 結(jié)果與分析

      4.1 實(shí)驗(yàn)菌株遷徙生長試驗(yàn)

      結(jié)果見表4。變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗(yàn)典型結(jié)果見圖1。接種變形桿菌的克氏雙糖鐵長斜面,肉眼可見整個(gè)斜面被漫延性生長 (四周擴(kuò)散)的灰白色菌苔基本覆蓋,呈陽性反應(yīng);而接種非變形桿菌的,菌株都未表現(xiàn)出向上的蔓延生長,有個(gè)別菌株出現(xiàn)了沿斜面向上浸潤生長 (液體附在固體表面上的漸漸滲入)的現(xiàn)象,其向上生長的菌苔沒有超過冷凝液面上1 cm(低于1/4斜面高度),呈陰性反應(yīng)。陽性與陰性的遷徙試驗(yàn)結(jié)果區(qū)分度明顯。

      (續(xù)表4)

      圖1 變形桿菌和非變形桿菌遷徙生長試驗(yàn)典型結(jié)果

      斜面菌苔的驗(yàn)證結(jié)果:培養(yǎng)24 h、48 h后,在所有變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株的血平板上均出現(xiàn)覆蓋膜樣生長的菌苔,并有惡臭味,所有非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株的血平板上均無菌生長。

      4.2 遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)

      遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見表5。其中,P9號菌株遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由表5可見,在菌落計(jì)數(shù)為10 CFU/500 μL以下時(shí),遷徙生長試驗(yàn)仍能呈現(xiàn)陽性結(jié)果。

      表5 遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果(CFU/500 μL)

      圖2 P9號菌株遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

      4.3 人工模擬樣品遷徙生長試驗(yàn)結(jié)果

      4.3.1 試驗(yàn)結(jié)果

      試驗(yàn)結(jié)果見表6、圖3。由表6、圖3可見,干擾菌對模擬樣品中變形桿菌遷徙試驗(yàn)結(jié)果沒有影響。

      表6 人工染菌模擬樣品遷徙生長試驗(yàn)結(jié)果

      圖3 人工模擬樣品遷徙生長試驗(yàn)結(jié)果

      4.3.2 斜面菌苔驗(yàn)證結(jié)果

      12個(gè)樣品劃線接種于MAC、桿顯平板培養(yǎng)24 h后,生長良好,在MAC平板上均為形態(tài)一致的無色半透明或透明、圓形菌落,大小1~2 mm,菌落生長處平板顏色由桔黃色變無色;在桿顯平板上均為形態(tài)一致的桔黃色至淺褐色菌落,大小1~3 mm,菌落生長處的培養(yǎng)基有的會(huì)變成黃色。經(jīng)生化鑒定分離菌都符合所加入的變形桿菌生化特征。

      5 結(jié)論與討論

      《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第8版[3]中第八部分腸桿菌科變形菌屬中,雖然沒有將“遷徙生長現(xiàn)象”在變形菌屬予以描述,但手冊的補(bǔ)充評注中將普通變形桿菌(P.vulgaris)和奇異變形桿菌(P.mirabilis)清楚描述“在固體培養(yǎng)基上有顯著的自發(fā)群集的特性;運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的一薄層以旋轉(zhuǎn)和帶狀的改變排列……”;雖然該版本將沒有“遷徙生長現(xiàn)象”特性的摩氏變形桿菌、無恒變形桿菌、雷氏變形桿菌也劃歸為變形桿菌屬,但作為《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》更新版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第2版[4],將他們同時(shí)分別歸類為摩根氏菌屬、普羅威登斯菌屬、雷特菌屬,稱為同模式異名(homotypic synonym)。本研究結(jié)果顯示這種“遷徙生長現(xiàn)象”是變形桿菌屬中普通變形桿菌、奇異變形菌、潘氏變形桿菌固有的,與其他細(xì)菌明顯不同的特征性特點(diǎn)。

      本試驗(yàn)應(yīng)用克氏雙糖鐵培養(yǎng)基(乳糖∶葡萄糖為10∶1)而沒有應(yīng)用TSI三糖鐵培養(yǎng)基(乳糖∶蔗糖∶葡萄糖為10∶10∶1),是因?yàn)楹笳弑惹罢叨嗪崽?,普通變形桿菌和潘氏變形桿菌都能分解蔗糖使斜面變黃、部分菌株除產(chǎn)硫化氫還會(huì)出現(xiàn)底層培養(yǎng)基離底,而奇異變形桿菌因不能分解蔗糖斜面為橘紅色或紅色;在克氏雙糖鐵上3種變形桿菌在斜面上都是一致的橘紅色或紅色,底層產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫但不會(huì)出現(xiàn)離底或培養(yǎng)基破裂的現(xiàn)象。本試驗(yàn)也沒有像文獻(xiàn)[10]那樣采用普通營養(yǎng)瓊脂斜面,因?yàn)樽冃螚U菌在普通營養(yǎng)瓊脂斜面上沒有糖發(fā)酵及產(chǎn)酸產(chǎn)硫化氫特點(diǎn),而且沿斜面產(chǎn)生菌苔遷徙生長沒有克氏雙糖培養(yǎng)基明顯,對于變形桿菌的鑒定效果不好。因此,本文最終選擇應(yīng)用克氏雙糖鐵斜面作為檢測載體。為了防止國產(chǎn)試劑配方差異導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定,選用國內(nèi)市場占有率較高的3個(gè)廠家的克氏雙糖試劑制成斜面,同時(shí)進(jìn)行以上3個(gè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,所有變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株均從斜面底的冷凝液中向上長出灰白色菌苔,并沿斜面向上蔓延生長,可覆蓋整個(gè)斜面,且“動(dòng)力十足”地向下往斜面底層生長并產(chǎn)硫化氫,為遷徙生長試驗(yàn)陽性;非變形桿菌實(shí)驗(yàn)菌株中,多數(shù)未出現(xiàn)肉眼可見的向上生長現(xiàn)象,個(gè)別出現(xiàn)輕微向上浸潤生長現(xiàn)象 (液體附在固體表面上的漸漸滲入現(xiàn)象),且不會(huì)超過冷凝水液面之上1 cm(小于斜面高度1/4位置),遷徙生長現(xiàn)象均呈陰性。遷徙生長試驗(yàn)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明,檢測低限可至少達(dá)到 3~7 CFU/500 μL,與文獻(xiàn)中 PCR 檢測方法相當(dāng)[11]。

      變形桿菌屬細(xì)菌遷徙生長的影響因素與特定的酸堿度環(huán)境等有關(guān),它的螺紋遷徙生長現(xiàn)象產(chǎn)生可能與其遺傳特性和地球的自轉(zhuǎn)有關(guān)[8]、瓊脂濃度和表面水分含量有關(guān)[6]、與細(xì)菌的傳代次數(shù)無關(guān)[7]、35℃、培養(yǎng)4 h就能開始遷徙生長[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在克氏雙糖鐵長斜面36±1℃、培養(yǎng)24 h,變形桿菌能很好地顯示其遷徙生長特性。

      本研究結(jié)果表明,應(yīng)用本研究開發(fā)的克氏雙糖鐵遷徙生長試驗(yàn)方法,能充分展示變形桿菌的遷徙生長特性,并且能方便、明顯地與其他細(xì)菌區(qū)分出來。人工染菌模擬樣品試驗(yàn)結(jié)果表明,將化妝品樣品的首次增菌液按本文方法進(jìn)行遷徙生長試驗(yàn),可以很方便地篩查出樣品中含有的微量變形桿菌。所以,遷徙生長現(xiàn)象可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。本文首創(chuàng)的“遷徙生長試驗(yàn)”可應(yīng)用于食品、化妝品等樣品變形桿菌的初篩檢測,既可以首次增菌液是否產(chǎn)生遷徙生長現(xiàn)象作為是否含有變形桿菌的初篩判斷依據(jù)之一,也可以在細(xì)菌分純培養(yǎng)后的遷徙生長試驗(yàn)陽性作為變形桿菌的特征性生化鑒定項(xiàng)目之一。

      本研究首創(chuàng)的“遷徙生長試驗(yàn)”操作簡單、成本低廉、易于判斷結(jié)果,可作為變形桿菌屬檢測的初篩項(xiàng)目或特征性生化鑒定項(xiàng)目之一。

      致謝:向?yàn)楸驹囼?yàn)提供部分實(shí)驗(yàn)菌種的天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所和深圳龍崗區(qū)疾控中心表示衷心感謝!

      [1]周庭銀,倪語星.臨床微生物學(xué)診斷與圖解(第3版)[M].上海:科學(xué)出版社,2012.

      [2]向輝,劉鋼,李標(biāo),等.廣州市天河區(qū)2005-2012年食源性疾病發(fā)生原因與流行病學(xué)特征分析 [J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,(24):4552-4555.

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