陳 佩 岳巧云 劉德星 陳利偉 邱德義* 何秋星

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州 510006；2.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局）

1 前言

細(xì)菌是非常重要的一類生物種群，與人類健康和社會(huì)發(fā)展息息相關(guān)[1]，一直是檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域的重點(diǎn)檢測(cè)對(duì)象，尤其在國境衛(wèi)生檢疫中，口岸醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶病原體的檢測(cè)對(duì)于防止蟲媒傳染病通過國境口岸輸入、輸出發(fā)揮著重要作用，而細(xì)菌作為病原體的一種，如何快速、準(zhǔn)確、全面地將其鑒定檢測(cè)出，是防控的基礎(chǔ)和前提[2]。傳統(tǒng)的細(xì)菌研究方法主要分為兩類，一是基于對(duì)細(xì)菌分離培養(yǎng)的生化鑒定方法，但絕大多數(shù)（99%以上）細(xì)菌無法在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行培養(yǎng)[3-4]；二是基于特異引物/探針/抗體的方法，均依賴于已知細(xì)菌的基因組序列，對(duì)于檢測(cè)未知的病原體存在很大的局限性[5]。

宏基因組學(xué)的興起以及二代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，可同時(shí)對(duì)上百份樣本進(jìn)行高通量核酸分子測(cè)序[6]，不依賴于細(xì)菌的分離培養(yǎng)，直接對(duì)樣品中所有的細(xì)菌進(jìn)行研究，進(jìn)而可以全面地對(duì)所有細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)分析[7]。目前二代測(cè)序技術(shù)已廣泛運(yùn)用于多個(gè)領(lǐng)域不同樣品中攜帶細(xì)菌的檢測(cè)分析，包括土壤[8]、人體腸道[9]、水體[10]、空氣[11]、媒介生物[12-13]等，然而從最初的細(xì)菌核酸提取到后期的數(shù)據(jù)分析，二代測(cè)序技術(shù)的結(jié)果質(zhì)量會(huì)受到多方面因素的影響，如細(xì)菌DNA的提取方法[14-15]，16S rRNA高變區(qū)的選擇[16-17]，測(cè)序文庫的構(gòu)建，測(cè)序平臺(tái)和策略的選擇[5]等。在實(shí)際檢驗(yàn)檢疫應(yīng)用中，基于攜帶病原體的宿主不同，待檢樣品中細(xì)菌物種多樣性豐富，細(xì)菌DNA的提取作為后續(xù)擴(kuò)增、測(cè)序和分析的基礎(chǔ)，如何高效率、全面地提取出樣品中的細(xì)菌DNA，對(duì)于結(jié)果的影響尤為突出。目前細(xì)菌DNA的提取方法多種多樣，原理各不相同，各有其優(yōu)缺點(diǎn)[18]。本研究比較了細(xì)菌的6種DNA提取方法，對(duì)混合細(xì)菌樣本進(jìn)行DNA提取，并特異性地?cái)U(kuò)增16S rRNA的V3-V4高變區(qū)基因，構(gòu)建文庫并分析測(cè)序結(jié)果中各種細(xì)菌的含量和相對(duì)分布，從而得到一種高效、適用范圍廣的細(xì)菌核酸提取方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)菌株共10種，包含5種革蘭氏陽性菌，分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌 （Bacillus cereus）、 糞腸球菌（Streptococcus faecalis）、馬紅球菌（Rhodococcus equi）、英諾克李斯特氏菌（Listeria innocua），以及5種革蘭氏陰性菌，分別是肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、綠膿桿菌 （Pseudomonas aeruginosa）、 大腸埃希菌（Escherichia coli）、腸沙門菌（Salmonella enterica）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）。以上菌株均為普通瓊脂斜面保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株，由中山出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供。

2.1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：MagPure Bacterial DNA KF Kit（Megen生物）；TIANamp Bacteria DNA Kit（天根生化科技有限公司）；GCM107營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；溶菌酶（源葉生物 R21037）；蛋白胨（AOBOX）；牛肉膏 （廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

儀器：全波長酶標(biāo)儀（Thermo ScientificTMMulti skanTMGo）；超聲波破碎儀（Sonics Vibra-Cell）；核酸提取儀（Thermo KingFisher Duo Prime）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠成像儀（UVltec）；PCR 儀（Life Technologies applied biosystems）；恒溫?fù)u床（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 單一菌種的培養(yǎng)及分子鑒定

2.2.1.1 菌種培養(yǎng)

采用分區(qū)劃線法分別將10種菌株接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h。隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到細(xì)菌菌液，保存于4℃冰箱備用。

2.2.1.2 細(xì)菌DNA提取

分別取10種細(xì)菌菌液1 mL置于1.5 mL離心管中，用核酸提取儀提取DNA，按照MagPure Bacterial DNA KF Kit說明書進(jìn)行樣品前處理，得到樣品消化液之后，采用核酸提取儀中的MagPure_Bacterial_DNA_Duo程序提取DNA。

2.2.1.3 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增細(xì)菌樣本16S rRNA基因，引物序列為：正向引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3′）[19]，PCR 體系為 50 μL：10 倍 PCR 緩沖液 5 μL；正向引物（20 μmol/L）和反向引物（20 μmol/L）各 2 μL；dNTP （10 μmol/L） 2 μL；Ex-Taq 1 μL；模板DNA 3 μL；無菌水定容至50 μL。PCR反應(yīng)條件 ：95℃ 變 性 5 min；94℃ 、40 s，50℃ 、30 s，72℃ 、2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)（100 V電壓，340 mA電流，電泳緩沖液為1×TAE，電泳25 min），凝膠系統(tǒng)成像并記錄。

2.2.1.4 測(cè)序及同源性分析

采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，將PCR產(chǎn)物送交上海立菲生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序引物同擴(kuò)增引物。將測(cè)序所得序列去除兩端引物部分，并與Gen-Bank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析。利用Maga 6.0軟件中的Test Maximum Likelihood tree，對(duì)10種細(xì)菌樣品的16S rDNA基因序列進(jìn)行ML進(jìn)化樹的分析。

2.2.2 制備混合菌液

以澆注平板培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，將10種菌液梯度稀釋至 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8cfu/mL 共 5 個(gè)濃度梯后，分別吸取每個(gè)梯度的混勻菌液0.2 mL于無菌平皿中，及時(shí)倒入15～20 mL冷卻至46℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)動(dòng)平板混勻，待平板凝固后，37℃倒置培養(yǎng)48 h；每個(gè)濃度梯度設(shè)置兩個(gè)平行。按照GB 4789.2—2010統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，并計(jì)算菌液濃度。根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，分別取濃度數(shù)量級(jí)為108cfu/mL的10種細(xì)菌樣本的菌液等量混勻，得到濃度數(shù)量級(jí)為107cfu/mL的混合菌液備用。

2.2.3 混合細(xì)菌的DNA提取

采用6種不同的方法分別提取混合菌液的DNA，每組設(shè)置3個(gè)平行樣，提取出的DNA作為模板DNA于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?種提取方法如下。

2.2.3.1 磁珠法

取1 mL混合菌液于1.5 mL離心管中作為實(shí)驗(yàn)樣品，具體步驟同2.2.1.2。其提取原理是基于高結(jié)合力的磁珠粒子的純化方式，在高濃度的離子化合劑條件下，磁珠可通過氫鍵和靜電作用吸附核酸，而蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)不被吸附，吸附了核酸的磁珠經(jīng)洗脫去除蛋白和鹽，然后用ddH2O洗脫最終得到的DNA溶液。

2.2.3.2 熱裂解法

取1 mL混合菌液于1.5 mL離心管中，95℃熱裂解10 min，13 000 g離心2 min收集上清至1.5 mL離心管中。

2.2.3.3 超聲波法

取1 mL混合菌液于5 mL養(yǎng)菌管中，置于冰盒上超聲間歇處理5 min（超聲2 s，間隔5 s，功率20%）[20]，超聲處理完后，13 000 g離心 2 min收集上清至1.5 mL離心管中。

2.2.3.4 試劑盒法（溶菌酶處理）

取1 mL混合菌液于1.5 mL離心管中作為實(shí)驗(yàn)樣品，按照TIANamp Bacteria DNA Kit說明書提取細(xì)菌DNA。

2.2.3.5 試劑盒法（無溶菌酶處理）

除了在樣品消化過程中不加入溶菌酶，略過步驟2，其余操作步驟同2.2.3.4。

2.2.3.6 超聲+熱裂解法

取1 mL混合菌液于5 mL養(yǎng)菌管中，置于冰盒上超聲間歇處理5min（超聲2s，間隔5s，功率20%），超聲處理完后，95℃熱裂解10 min，13 000 g離心2 min收集上清至1.5 mL離心管中。

2.2.4 混合菌液DNA的PCR擴(kuò)增

分別以6種方法提取出的混合菌液DNA為模板，擴(kuò)增其16S rRNA的V3-V4高變區(qū)基因。擴(kuò)增引物為：正向引物 341F（5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′）和反向引物 806R（5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′）[21]，PCR 體系為 50 μL：2×PCR 緩沖液 25 μL；正向引物（20 μmol/L）和反向引物（20 μmol/L）各 1 μL；dNTP（10 μmol/L） 2.5 μL；KOD FX Neo 1μL；模板 DNA 3μL；無菌水定容至50μL。PCR反 應(yīng) 條 件 ：94℃ 變 性 2 min；98℃ 、10 s，50℃ 、30 s，68℃、30 s，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸 10 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，PCR經(jīng)產(chǎn)物電泳檢測(cè)（100 V電壓，340 mA電流，電泳緩沖液為 1×TAE，電泳 25 min），凝膠系統(tǒng)成像并記錄。

2.2.5 二代測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

PCR產(chǎn)物直接送交華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用Illumina HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)，測(cè)序策略為PE300。測(cè)序流程主要為：先對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，DNA總量不低于1.5 μg即可滿足建庫測(cè)序要求；然后回收目的Amplicon片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK 將打斷形成的粘性末端修復(fù)成平末端，再通過3'端加堿基“A”，使得DNA片段能與3'端帶有“T”堿基的特殊接頭連接；最后，用合格的文庫進(jìn)行cluster制備和測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的reads后，通過reads之間的overlap關(guān)系拼接成Tags，拼接的Tags經(jīng)過優(yōu)化后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU（Operational Taxonomic Units）。

2.2.6 不同提取方法的比較

對(duì)于6種提取方法主要從兩方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，一方面，提取出的混合細(xì)菌DNA是否滿足二代測(cè)序建庫的要求，包括：（1）PCR產(chǎn)物的電泳條帶是否清晰明亮；（2）PCR產(chǎn)物中目的DNA總量不低于1.5 μg。另一方面，二代測(cè)序結(jié)果是否能反應(yīng)樣品的真實(shí)情況，包括：OTU數(shù)、細(xì)菌種類的鑒定、不同細(xì)菌的相對(duì)含量分布情況。測(cè)序結(jié)果中OTU的豐度說明了樣品的物種豐富程度，通過統(tǒng)計(jì)測(cè)序結(jié)果中OTU的數(shù)量以及每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的序列數(shù)，可得到樣品中細(xì)菌種數(shù)及不同細(xì)菌的相對(duì)含量，然后將測(cè)序結(jié)果與樣品的實(shí)際情況進(jìn)行比較，從而分析不同方法之間細(xì)菌種類鑒定和相對(duì)含量分布準(zhǔn)確性的差異。

3 結(jié)果

3.1 單一菌種的鑒定

凝膠電泳成像后，擴(kuò)增16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物均有長度約為1 500 bp的條帶。將測(cè)序所得序列去除兩端引物部分，并與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果詳見表1，10種細(xì)菌均能被準(zhǔn)確鑒定到種的水平，表明了實(shí)驗(yàn)菌種的準(zhǔn)確性。

表1 10種細(xì)菌樣本的鑒定結(jié)果

將10種細(xì)菌的16S rRNA及其V3-V4高變區(qū)基因序列分別進(jìn)行ML樹分析 （圖1），16S rRNA基因序列進(jìn)化樹表明10種細(xì)菌的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，運(yùn)用16S rRNA基因序列能將其準(zhǔn)確地劃分到不同的種；而在16S rRNA V3-V4高變區(qū)基因序列進(jìn)化樹中，僅大腸埃希氏菌和弗氏志賀菌未被區(qū)分開。

圖1 10種細(xì)菌的進(jìn)化樹分析圖

3.2 6種方法中混合細(xì)菌的鑒定

3.2.1 混合細(xì)菌DNA的濃度、純度及PCR結(jié)果

由表2可知，6種方法中，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）提取出的DNA濃度較低，均值低于10 ng/μL，其余4種方法的濃度相近，均值大于40 ng/μL；熱裂解法提取出的DNA純度最低，其余5種方法純度均大于1.6，其中試劑盒法（溶菌酶處理）的純度最高。

表2 6種提取方法所得細(xì)菌DNA的濃度及純度測(cè)定結(jié)果

6種方法提取出的混合細(xì)菌DNA濃度和純度各不相同，但經(jīng)PCR擴(kuò)增后，凝膠成像見圖2，均有長度約為550 bp的明亮條帶，且其PCR產(chǎn)物中目的片段的總量均不低于1.5 mg，滿足建庫測(cè)序的要求。

圖2 混合菌液DNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.2.2 二代測(cè)序結(jié)果

3.2.2.1 OTU豐度分析

混合菌液樣本中共包含10種細(xì)菌，理想的測(cè)序結(jié)果應(yīng)該是將所有序列聚類為10種OTU，并且對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋能準(zhǔn)確地鑒定出樣品中的10種細(xì)菌。磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）測(cè)序結(jié)果的OTU數(shù)均為9，無雜質(zhì)OTU，其余4種方法的OTU數(shù)均大于10，其中超聲法的OTU均數(shù)為15，試劑盒法（無溶菌酶處理）為12，熱裂解法和超聲+熱裂解法的OTU數(shù)均超過了30。表明通過磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）提取細(xì)菌DNA，其測(cè)序結(jié)果中OTU的數(shù)目與樣品的真實(shí)數(shù)目最為接近。

3.2.2.2 菌種種類鑒定

由表3可知，6種方法的測(cè)序結(jié)果中均只能將5種細(xì)菌鑒定到種的水平，分別為腸沙門氏菌、大腸埃希氏菌、馬紅球菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，將4種細(xì)菌鑒定到屬的水平，分別為克雷伯氏菌屬、李斯特氏菌屬、腸球菌屬和假單胞菌屬，而弗氏志賀氏菌均未被鑒定出。

3.2.2.3 菌種相對(duì)數(shù)量

混合菌液樣品中10種細(xì)菌均是等量加入，而在測(cè)序結(jié)果中，同一方法不同菌種的相對(duì)數(shù)量分布各不相同，馬紅球菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌屬的量在磁珠法、試劑盒法（溶菌酶處理）和超聲+熱裂解法中明顯低于平均值（10%）；熱裂解法中大腸埃希菌和假單胞菌屬的量，以及超聲法中假單胞菌屬的量遠(yuǎn)高于平均值，而這兩種方法中其余菌種的量均較低；試劑盒法（無溶菌酶處理）中除了假單胞菌屬遠(yuǎn)高于平均值以及大腸埃希菌和克雷伯菌屬的量接近平均值，其余菌種的量均低于平均值。不同方法之間，同一菌種的分布也不相同；馬紅球菌和李斯特菌屬在試劑盒法（溶菌酶處理）中提取得率最高，金黃色葡萄球菌在試劑盒法（無溶菌酶處理）中最高，但這3種菌在6種方法中提取率均低于平均值；蠟樣芽孢桿菌和腸球菌屬的量僅在磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）中高于平均值；而大腸埃希菌除了在超聲法中得率低于平均值，在其余5種方法中均較高；假單胞菌屬在6種方法中的得率均較高；腸沙門菌和克雷伯菌屬的量在熱裂解法和超聲法中均較低。

對(duì)6組測(cè)序結(jié)果中樣品菌種的相對(duì)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算樣品菌種的序列數(shù)占總序列數(shù)的比例（表3），繪制柱狀圖，圖3直觀地反映了6種方法中樣品菌種的相對(duì)分布情況。由圖可觀察到磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）中各種細(xì)菌的含量分布相對(duì)均勻，最為接近樣品中細(xì)菌含量分布的真實(shí)情況。

表3 6種方法測(cè)序結(jié)果中不同細(xì)菌的序列條數(shù)分布

圖3 6種方法中各種細(xì)菌數(shù)據(jù)量的相對(duì)分布

4 討論

結(jié)果表明，6種提取方法對(duì)于二代測(cè)序結(jié)果的影響主要體現(xiàn)在OTU豐度和菌種相對(duì)數(shù)量上，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）的OTU數(shù)最接近真實(shí)數(shù)量，無雜質(zhì)OTU；而超聲法和試劑盒法（無溶菌酶處理）比真實(shí)數(shù)量稍多，熱裂解法和超聲+熱裂解法則遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了真實(shí)數(shù)量；說明磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）測(cè)序結(jié)果較為準(zhǔn)確，其他4種提取方法對(duì)于OTU豐度有明顯影響，從而導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果與真實(shí)結(jié)果相差較大。6種方法的二代測(cè)序結(jié)果中，菌種相對(duì)數(shù)量分布結(jié)果均不準(zhǔn)確，不同的提取方法對(duì)于細(xì)菌DNA的提取影響顯著，在同一方法中，不同細(xì)菌的提取效果差別很大，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）的結(jié)果中各種菌的分布情況相對(duì)均勻，最能反映樣品中各種細(xì)菌含量的真實(shí)情況；對(duì)比試劑盒法（無溶菌酶處理）和試劑盒法（溶菌酶處理）的結(jié)果可知，可能是因?yàn)榧尤肴芫柑幚砟軠p小細(xì)菌提取過程中所造成的結(jié)果偏倚；比較超聲+熱裂解法、熱裂解法和超聲法可知，超聲+熱裂解法相較于單獨(dú)的熱裂解法和超聲法其結(jié)果均勻度有所提高。對(duì)同一種細(xì)菌使用不同方法的提取效果差別也很大，在加入溶菌酶的磁珠法和試劑盒法中，蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌的數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)高于另外4種不加溶菌酶的方法，說明溶菌酶處理對(duì)于樣本中蠟樣芽孢桿菌和大腸埃希氏菌的檢測(cè)至關(guān)重要。

本研究中，混合菌液樣品共加入10種細(xì)菌，特異性擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3-V4高變區(qū)基因用于二代測(cè)序分析，而6種方法均未將弗氏志賀菌鑒定出來。弗氏志賀菌和大腸埃希菌屬于2個(gè)不同的屬，分別為志賀菌屬和埃希菌屬，圖1的ML進(jìn)化樹表明了用16S rRNA基因可以準(zhǔn)確將這2種細(xì)菌區(qū)分開，但由于弗氏志賀菌的V3-V4高變區(qū)基因序列和大腸埃希菌的相似度為100%，無堿基差異，因此導(dǎo)致二代測(cè)序結(jié)果中未將2種細(xì)菌分開，可能將弗氏志賀菌都聚類為了大腸埃希菌，而這一結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了擴(kuò)增16S rRNA不同高變區(qū)基因會(huì)對(duì)細(xì)菌樣品構(gòu)成的分析結(jié)果產(chǎn)生明顯的影響[16-17]。

5 結(jié)論

綜合考慮6種方法對(duì)二代測(cè)序結(jié)果的影響，磁珠法和試劑盒法（溶菌酶處理）用于提取混合細(xì)菌基因組DNA的效果最好，但其結(jié)果并不是十分理想，可能將多種方法結(jié)合使用會(huì)有更好的效果。鑒于傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定檢測(cè)的不足，二代測(cè)序作為高通量快速檢測(cè)技術(shù)，給全面快速地檢測(cè)樣品，尤其是醫(yī)學(xué)媒介生物攜帶細(xì)菌病原體的情況提供了可能，但二代測(cè)序結(jié)果質(zhì)量的影響因素較多，仍需后續(xù)更全面深入的研究和優(yōu)化。

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