高芳芳, 劉軍英, 鹿文慧, 李金花*, 劉惠濤

(1. 煙臺大學化學化工學院, 山東 煙臺 264005; 2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所,中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室, 山東 煙臺 264003)

酚類雌激素(phenolic estrogens, PEs)是指結(jié)構(gòu)中含有酚基且具有類雌激素效應(yīng)的化合物,由于其具有較高的脂溶性,極易被生物體富集,威脅生態(tài)系統(tǒng),嚴重危害人類健康和發(fā)展,從而成為人們重點關(guān)注的對象[1]。己烷雌酚(HS)、雙烯雌酚(DS)、己烯雌酚(DES)和雙酚A(BPA)4種PEs被廣泛應(yīng)用于促進畜禽生長,提高牛奶產(chǎn)量,增加瘦肉率等[2]。雙酚A作為環(huán)氧樹脂等工業(yè)原料的前體物質(zhì),是最常見的內(nèi)分泌干擾物之一[3,4]。此外,已經(jīng)證明PEs廣泛存在于環(huán)境中的水體、沉積物等基質(zhì)中[5,6],在環(huán)境基質(zhì)中的含量在0～10 ng/g范圍內(nèi),在污水中的含量更高[7]。PEs可以通過食物鏈進入人體,使人體的代謝紊亂,破壞生理平衡,甚至癌變[8,9]。PEs的含量在幾ng/L的質(zhì)量濃度水平就會對人體的代謝產(chǎn)生影響[10]。很多國家和地區(qū)已經(jīng)規(guī)定了這類雌激素在水體中的最大殘留量為0.1 μg/L或者更低的質(zhì)量濃度。因此,快速準確地檢測這類化合物是十分必要的。

目前,檢測PEs的方法主要有高效液相色譜[11,12]、氣相色譜[13]、毛細管電泳(CE)[14]及免疫法[15]等。近年來,CE以其柱效高、分析速度快、試劑消耗少等特點發(fā)展迅速,已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[16]。然而,由于CE進樣量少,紫外檢測器的光程短,因此檢測的靈敏度較低[17]。CE的在線富集技術(shù)是其特有的富集方法,只需對樣品溶液和儀器進行適當?shù)恼{(diào)整,即可實現(xiàn)樣品的在線堆積,操作簡便[18,19]。壓力輔助電動進樣(pressure-assisted electrokinetic injection, PAEKI)是通過調(diào)節(jié)給定電壓下的壓力或者是給定壓力下的電壓來使毛細管內(nèi)的電滲流保持平衡,在此狀態(tài)下,再采用電動進樣[20]。目前,CE-PAEKI已被廣泛用于砷、硒等的形態(tài)分析[21],精氨酸、咪唑的分析[22],以及人工尿液中維替泊芬藥物的手性拆分和檢測[23]等。

我們擬以HS、DS、DES和BPA這4種PEs為研究對象,采用PAEKI的在線富集方式實現(xiàn)其在毛細管入口端的堆積富集,提高CE-UV的靈敏度[24]。對影響富集效果的條件進行優(yōu)化,包括進樣電壓、進樣時間、注入水柱的選擇等[25,26]。相較于普通的壓力進樣,該PAEKI法簡單、快速,可以得到較高的富集倍數(shù)和更低的檢出限。我們采用膠束電動色譜(MEKC)模式進行了電泳分離[27],結(jié)合PAEKI,實現(xiàn)了對自來水和湖水中4種PEs的同時高效測定,為雌激素的痕量分析提供了一種快速、準確、靈敏的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

P/ACE MDQ CE毛細管電泳儀(美國貝克曼公司),檢測器為二極管陣列檢測器;裸熔融石英毛細管(內(nèi)徑75 μm,外徑375 μm,總長50.2 cm,有效分離長度40 cm)(河北永年光導(dǎo)纖維廠);雷磁PHs-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司); TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

HS、DS、DES、BPA 4種PEs的標準品(純度不低于98%)均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海阿拉丁公司。色譜級乙腈和甲醇購自北京百靈威化學公司;其他化學試劑如氫氧化鈉(NaOH)、硼砂(Na2B4O7510H2O)等均為分析純,均購自國藥集團化學試劑有限公司。超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備,電阻率為18.2 MΩ5cm。

自來水取自實驗室,自流5 min后收集;湖水取自煙臺大學校園內(nèi)的人工湖。采集時分別用自來水和湖水沖洗取樣器3次,并采用0.22 μm親水性聚丙烯濾膜過濾,過濾后的樣品置于4 ℃冰箱保存。

1.2 溶液配制

標準溶液:準確稱取適量的標準物質(zhì)溶于甲醇,配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標準貯備液,用超純水稀釋標準溶液得到相應(yīng)濃度的工作溶液,于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

圖 1 電壓對4種PEs峰高的影響Fig. 1 Effect of voltage on the peak height of four phenolic estrogens (PEs) HS: hexestrol; BPA: bisphenol A; DES: diethylstilbestrol; DS: dienestrol.

MEKC緩沖溶液:由10 mmol/L Na2B4O7510H2O、20 mmol/L的SDS和40% (v/v)的乙腈組成,用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)緩沖液pH為10.8。1.3實驗方法

新使用的毛細管分別用超純水、1.0 mol/L的NaOH、超純水和緩沖溶液依次沖洗10、40、10和30 min。每天使用前用超純水、1.0 mol/L的NaOH、超純水和緩沖溶液沖洗2、10、5和5 min。兩次進樣間隔使用緩沖溶液沖洗3 min。

檢測條件:分離電壓為+28 kV;檢測波長228 nm; PAEKI進樣條件為-9 kV電壓下壓力進樣,進樣壓力0.3 psi (約2.1 kPa),進樣時間0.4 min,不注入水柱進樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 進樣條件的優(yōu)化

采用PAEKI的進樣方式在線富集分析物,對影響堆積效率的參數(shù)進行了優(yōu)化。

2.1.1進樣電壓的優(yōu)化

首先,設(shè)置壓力為0.3 psi (約2.1 kPa),進樣時間為0.4 min,對進樣電壓進行考察。如圖1所示,富集效率隨著進樣電壓的增大而升高,可見電壓越大,有越多的分析物進入毛細管,堆積效果越好。然而,當電壓過大時,峰形開始變差,峰高開始減小,這可能是因為過大的電滲流將分析物推出毛細管口,使堆積效果變差。此外,我們還發(fā)現(xiàn)當電壓較大時,電泳分離容易出現(xiàn)斷流情況,重復(fù)性較差,且和毛細管柱的使用程度、沖洗狀態(tài)有較大的關(guān)系。在進樣電壓為-9 kV時,有最好的峰形和堆積效果。因此,選擇進樣電壓為-9 kV,進樣壓力為2.1 kPa。

2.1.2進樣時間的優(yōu)化

在電壓-9 kV、壓力2.1 kPa條件下對進樣時間進行了考察。從圖2可以看出,在0.2～0.4 min時,堆積效果隨著進樣時間的增加而增加;但當時間超過0.4 min以后,峰高增加不明顯,且DES和DS的峰高有所下降。當進樣時間為0.5 min時,峰形展寬,分離度下降,這可能是進樣量過多的原因。因此,選擇進樣時間為0.4 min。

圖 2 進樣時間對4種分析物峰高的影響Fig. 2 Effect of injection time on the peak height of the four PEs

2.1.3注入水柱的選擇

進一步考察電泳的在線富集效果,在壓力輔助電動進樣之前,預(yù)先注入一段水柱(0.5 psi (約3.4 kPa), 6 s)?？疾炝祟A(yù)先引入水柱對于富集效果的影響,發(fā)現(xiàn)電泳檢測時斷流情況較為嚴重,且分析物峰形較差。因此選擇不注入水柱進樣。

2.2 PAEKI和普通進樣的對比

圖3給出了在相同的分析物濃度條件下,普通壓力進樣(3.4 kPa, 3 s)的電泳圖和最優(yōu)的PAEKI條件(-9 kV, 2.1 kPa)下的電泳圖?？梢钥闯?PAEKI和普通的壓力進樣相比具有較明顯的堆積效果。在最優(yōu)的PAEKI條件下,4種分析物的富集倍數(shù)是普通壓力進樣的11～15倍。

2.3 線性關(guān)系及檢出限

在最優(yōu)的電泳條件下,4種分析物在7 min內(nèi)基線分離。配制質(zhì)量濃度為0.05～10 mg/L的混合標準溶液,在最優(yōu)的PAEKI的條件下進行電泳分析,以分析物的峰高為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制校正曲線,4種雌激素在各自的范圍(HS和DS為0.05～5 mg/L, BPA和DES為0.1～10 mg/L)內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.993 6。以目標物的峰高與背景噪聲的3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(LOD)。由表1可見,4種分析物的檢出限為0.007 1～0.017 mg/L,達到痕量分析要求。

圖 3 (a)普通壓力進樣和(b)壓力輔助電動進樣的電泳圖Fig. 3 Electrophoregrams of (a) usual pressure injection and (b) pressure-assisted electrokinetic injection (PAEKI) a. The mass concentrations of HS, BPA, DES, and DS were 1, 2, 2 and 1 mg/L, respectively; b. The mass concentrations of HS, BPA, DES, and DS were 2.5, 5, 5 and 2.5 mg/L, respectively.

表 3 自來水和湖水樣品中4種雌激素的加標回收率和相對標準偏差(n=5)

ND: not detected.

y: peak height;x: mass concentration, mg/L.

采用質(zhì)量濃度分別為5、10、10和5 mg/L的HS、BPA、DES和DS的混合標準溶液,對MEKC-PAEKI測定4種PEs的精密度進行了考察。由表2可見,遷移時間的日內(nèi)精密度為0.1%,日間精密度為1.3%～2.0%;峰面積的日內(nèi)精密度為2.2%～2.8%,日間精密度為2.6%～3.3%。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠,適于準確測定。

表 2 PAEKI測定PEs遷移時間和峰面積的精密度*

* Spiking HS, BPA, DES, and DS at 5, 10, 10, and 5 mg/L, respectively.

2.4 實際樣品檢測及加標回收試驗

為進一步評價方法的實際應(yīng)用價值,將建立的MEKC-PAEKI方法用于自來水和湖水樣品中4種PEs殘留的檢測。以目標物的峰高與背景噪聲10倍信噪比(S/N)計算方法的定量限(LOQ)。4種分析物在自來水中的LOQ分別為0.064 mg/L(HS)、0.029 mg/L(BPA)、0.063 mg/L(DES)和0.034 mg/L(DS),在湖水中的LOQ分別為0.071 mg/L(HS)、0.033 mg/L(BPA)、0.079 mg/L(DES)和0.038 mg/L(DS)?？梢?此方法能夠?qū)嶋H水樣中的痕量雌激素進行定量分析。

圖 4 自來水、湖水空白樣品和加標樣品中4種PEs的電泳圖Fig. 4 Electrophoregrams of the four PEs in blank and spiked samples of tap water and lake water a. without spiking; b. spiked with 0.5 mg/L HS, 1 mg/L BPA, 1 mg/L DES and 0.5 mg/L DS; c. spiked with 1 mg/L HS, 2 mg/L BPA, 2 mg/L DES and 1 mg/L DS.

對實際樣品進行加標回收實驗,自來水、湖水樣品中4種雌激素的加標水平分別為0、0.5、1或2 mg/L,每個水平進行5次平行實驗。測定結(jié)果見表3,電泳圖見圖4。由表3可以看出,自來水中4種PEs的加標回收率為80.1%～110.1%,相對標準偏差為5.4%～11.8%;湖水樣品中加標回收率為75.6%～105.9%,相對標準偏差為4.6%～10.9%。以上結(jié)果表明,所建立的MEKC-PAEKI方法適用實際水樣中多種酚類雌激素殘留的同時分離和檢測。

3 結(jié)論

本實驗采用MEKC-PAEKI方法對自來水和湖水中痕量酚類雌激素進行在線富集和分析檢測。PAEKI具有較好的富集效果,實際水樣分析結(jié)果滿意。PAEKI不需要樣品前處理的富集過程,只需要對儀器進行簡單的調(diào)試,方法簡單、快速、無污染。并且,對于環(huán)境中基質(zhì)復(fù)雜的樣品,PAEKI還可以和其他的樣品前處理技術(shù)連用,如液液萃取和固相萃取,進一步凈化和富集樣品,提高富集倍數(shù),降低檢出限,為酚類雌激素的檢測提供了一條行之有效的途徑。

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