曹文卿, 吳振興, 梁成珠, 靜 平, 崔淑華, 楊桂朋, 林黎明*

(1. 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 山東 青島 266002; 2. 中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 山東 青島 266100)

溴氰菊酯(deltamethrin)屬于高毒力菊酯類廣譜殺蟲劑,分子式C22H19Br2NO3,相對分子質(zhì)量為505.20,純品為白色斜方針狀晶體,常溫下難溶于水,能溶于多種有機溶劑,對光和氧不敏感,能夠穩(wěn)定存在于酸性介質(zhì)中,但在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。對人和動物具有神經(jīng)毒性、生殖毒性等毒害作用,因其在人和動物體內(nèi)代謝十分迅速,在含量低的情況下很難檢測出尿中的原型;1R,3R-二溴菊酸(簡稱二溴菊酸,(1R-cis)-3-(2,2-dibromoethenyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylic acid, dibromochrysanthemic acid)和3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid, 3-PBA)是溴氰菊酯分子的兩個組成部分[1,2], 3-PBA是多種菊酯殺蟲劑相同的代謝物,因而二溴菊酸與3-PBA可作為溴氰菊酯特異性的代謝標志物[3]。

近年來,隨著溴氰菊酯應(yīng)用區(qū)域的不斷拓展,溴氰菊酯的毒理實驗亦逐漸擴展到對哺乳動物的“三致”作用、代謝過程等多層次的研究[4-6]。為評估其生態(tài)風(fēng)險,許多學(xué)者首先從生物化學(xué)方向探究污染物對生物的初步毒害[7],其中生物標志物法是目前病理學(xué)、毒理學(xué)的前沿研究內(nèi)容[8-12],該方法因為測定指標全面、精確、科學(xué)而獲得普遍認可[13-15]。由于8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine, 8-OHdG)作為DNA氧化損傷標志物在氧化應(yīng)激疾病診療評價中具有重要意義[16],本文將其作為同時檢測的相關(guān)生物標志物。

在機體對化學(xué)物質(zhì)暴露的生化反應(yīng)中,比較重要的病理變化標志物,比如能夠精確指示器官、組織或者細胞器受損害程度的標志物可用作持續(xù)暴露的生物標志物。由于8-OHdG、6-甲氧基鳥嘌呤(6-methoxyguanine)、5-羥色胺(serotonin hydrochloride, 5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole-3-aceticacid, 5-HIAA)、三硝基丙酸(3-nitropropionic acid, 3-NPA)等均表現(xiàn)出與所研究的生物學(xué)現(xiàn)象的關(guān)聯(lián)性,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,所以也選作溴氰菊酯的毒理作用生物標志物。

本文以溴氰菊酯對家兔染毒暴露后可能形成的多種生物標志物以及溴氰菊酯的特異性代謝產(chǎn)物和溴氰菊酯為研究對象,應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了同時測定兔尿中二溴菊酸、3-PBA、8-OHdG、6-甲氧基鳥嘌呤、5-HT、5-HIAA和3-NPA等組合生物標志物的分析方法。為溴氰菊酯暴露風(fēng)險以及環(huán)境毒理學(xué)評估提供簡便、快速、準確的檢測技術(shù)[17]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API4000Q型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀配電噴霧離子源(美國AB公司); Agilent 1100液相色譜儀(美國Agilent公司);渦旋振蕩混合器(美國Thermo公司); Sigma低溫離心機(美國Sigma公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀(德國Heidolph公司); Midea Mi-L213C微波爐(微波火力檔) (美的公司); Gilson移液器(法國Gilson公司);氮吹儀(美國Jic公司); Millipore超純水儀(美國Merck Millipore公司)。固相萃取小柱:Waters Oasis HLB(200 mg/6 mL) (Waters公司)。

甲醇、乙腈、正己烷為色譜純,甲酸、乙酸為農(nóng)殘級試劑,均購自迪馬公司;氫氧化鈉、鹽酸、甲酸銨、維生素C(VC)、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、三氯乙酸、氨水、硅藻土(平均粒徑150目,平均孔徑6 nm,比表面20～70 m2/g)等均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑公司,水由Millipore超純水儀制備。

標準品:溴氰菊酯、二溴菊酸、3-PBA、8-OHdG、6-甲氧基鳥嘌呤、5-HT、5-HIAA、3-NPA(純度大于98%),均購自Witega公司。

1.2 標準溶液及試劑的配制

生物標志物的標準儲備液分別由標準品采用適當溶劑配制:3-苯氧基苯甲酸和二溴菊酸用乙腈溶解定容,8-羥基脫氧鳥苷和6-甲氧基鳥嘌呤用0.2%(v/v)甲酸水溶解定容,3-硝基丙酸、5-羥色胺和5-羥吲哚-3-乙酸分別用甲醇水(1∶1, v/v)溶解定容,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L儲備液(-20 ℃避光保存);儲備液進一步用相應(yīng)溶劑稀釋配制成10 mg/L的標準中間液(-20 ℃避光保存); 5-羥色胺、5-羥吲哚-3-乙酸等光敏性物質(zhì)須特別注意避光。5-羥色胺儲備液有效期為6個月,其余為12個月;實驗過程中用0.2% (v/v)的甲酸水溶液稀釋標準中間液,配制成混合標準工作液,于4 ℃下避光保存。

抗氧劑(VC溶液):用純水配制10 g/L的VC溶液,4 ℃下避光保存,有效期為7天;甲酸銨緩沖液:用純水配制1 mol/L的甲酸銨溶液,用氨水和甲酸調(diào)節(jié)pH為9.15左右。蛋白質(zhì)沉淀溶液:10% (v/v)的三氯乙酸溶液;脫脂溶液:乙腈飽和正己烷;提取液:2.5%(v/v)乙腈水溶液;流動相:A為乙腈,B為0.1% (v/v)甲酸水溶液(含5.0 mmol/L甲酸銨)。

1.3 動物實驗及實驗材料的前處理

1.3.1實驗材料

實驗用兔由青島康大食品有限公司種兔養(yǎng)殖場提供,用溴氰菊酯按一定劑量染毒后,定期收集尿液,按時間順序編號貼標簽,儲存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2提取

準確量取1 mL尿樣至15 mL聚丙烯離心管中,加入10 μL抗氧劑溶液和0.1 mL蛋白質(zhì)沉淀溶液以及0.1 g硅藻土,渦旋1 min, 4 ℃下10 000 r/min離心10 min,分離上清液;再用4 mL 2.5%(v/v)乙腈水溶液渦旋1 min后微波輔助提取殘渣(30 s), 10 000 r/min離心5 min;合并上清液,用甲酸銨緩沖液調(diào)節(jié)pH至5.8～7.5,待凈化。

1.3.3凈化

1.3.2節(jié)所得提取液經(jīng)5 mL脫脂溶液脫脂后加載至預(yù)先用2 mL甲醇和2 mL水活化好的HLB小柱上,控制流速為1 d/s,待上清液全部通過小柱,再用5 mL 2.5%(v/v)乙腈水溶液淋洗小柱,正壓干燥3 min,用3 mL甲醇分兩次洗脫目標物,用15 mL圓底聚丙烯離心管收集全部洗脫液,于40 ℃下氮氣流濃縮至近干,1 mL乙腈-水(1∶9, v/v)溶液復(fù)溶目標物,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,吸取上清液至棕色進樣小瓶,HPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

分析儀器為Agilent 1200高效液相色譜儀,配AB4000Q-TRAP (美國AB公司)。色譜柱:Phenomenex Luna 5u C8(150 mm×2.0 mm, 5.0 μm);柱溫:25 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣量:5 μL。梯度洗脫程序:0～3 min, 10%A; 3～5 min, 10%A～90%A; 5～9 min, 90%A; 9.1～15 min, 10%A。

電離方式:ESI+& ESI-;采集模式:MRM;離子源溫度:550 ℃;霧化氣壓力:0.31 MPa;氣簾氣壓力:0.207 MPa;輔助氣壓力:0.369 MPa;電噴霧電壓:+5 500 V &-4 500 V。各目標分析物的具體MRM設(shè)置條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取凈化條件的選擇

2.1.1微波輔助提取對5-HT、5-HIAA等敏感化合物回收率的影響

由于5-HT、5-HIAA對光不穩(wěn)定,為提高這類化合物的提取效率,分別量取兩組兔尿樣品(1.0 mL)于15 mL聚丙烯離心管中,添加等量溴氰菊酯與7種生物標志物的標準溶液,同時加入10 μL抗氧劑溶液和0.1 mL蛋白質(zhì)沉淀溶液以及0.1 g硅藻土,渦旋1 min, 4 ℃下10 000 r/min離心10 min,分離上清液;用4 mL 2.5%(v/v)乙腈水溶液渦旋1 min對殘渣進行重復(fù)提取時,一組采用微波輔助提取殘渣(30 s),另一組作對照,其余操作同1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié),對比各化合物的回收率測定結(jié)果。結(jié)果顯示:應(yīng)用微波輔助萃取的一組中5-HT、5-HIAA等敏感化合物的回收率明顯高于對照組,同時對其余化合物的回收率也有不同程度的提高。說明微波輔助提取效率高,能加速目標物從硅藻土以及器壁的解吸附過程,減少了操作過程中化合物的降解。

表 1 8種目標化合物的保留時間及MS/MS參數(shù)

*Quantitative ion pair.

2.1.2抗氧劑用量的優(yōu)化

分別等量量取尿液樣品24份,分為4組,每組包含樣品空白和添加回收各3個平行樣,7種生物標志物添加水平均為100 μg/L; 1、2、3組加入抗氧劑的量分別為5、10和15 μL;第4組為對照(不加抗氧劑);按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述步驟處理,經(jīng)HPLC-MS/MS分析后,計算各組樣品中生物標志物的回收率。結(jié)果顯示:對于8-OHdG、6-甲氧基鳥嘌呤、5-HT和1R,3R-二溴菊酸而言,對照組中回收率普遍低于加入抗氧劑的實驗組,回收率大小順序依次為:第3組≈第2組>第1組>對照組;第2、3組的回收率結(jié)果無明顯差別;而對于3-NPA、5-HIAA和3-PBA而言,對照組和實驗組的回收率沒有顯著差異。說明在處理過程中使用抗氧劑VC有利于多數(shù)化合物的穩(wěn)定,因而確定每個樣品抗氧劑用量為10 μL。

2.1.3蛋白質(zhì)沉淀劑的選擇

等量量取16份空白兔尿樣品于15 mL聚丙烯離心管中,每份1.0 mL兔尿,分成4組,每組包括樣品空白(sb)和添加回收(rec)各兩個平行樣品;前3組分別加入0.1 mL 10%(v/v)三氯乙酸水溶液、220 g/L的乙酸鋅水溶液、106 g/L的亞鐵氰化鉀水溶液作為沉淀劑,第4組作為對照不使用沉淀劑。其余按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述步驟進行操作?；厥章式Y(jié)果為:第1組>第2組>第3組>第4組,同時第1組的譜圖中雜質(zhì)干擾較少;綜合評價第1組凈化效果最好,因而選擇10%(v/v)三氯乙酸水溶液作為蛋白質(zhì)沉淀劑。

2.1.4固相萃取小柱的選擇

分別考察了NH2、WCX、HLB、Al-N等固相萃取小柱對加標兔尿樣品的凈化效果。通過分別測定上樣流出液、淋洗流出液和最后甲醇洗脫部分的目標物含量,發(fā)現(xiàn)4種小柱中只有HLB小柱能在上樣階段完全保留全部生物標志物,而且用有機相比例低于5% (體積分數(shù))的溶液淋洗雜質(zhì)時未導(dǎo)致目標物丟失,最后洗脫部分中所有目標物的回收率都在可接受范圍內(nèi)。因此選擇HLB固相萃取小柱用于尿液樣品中生物標志物的凈化。實驗表明,pH值在5.8～7.5之間時凈化效果較好。

2.1.5旋蒸濃縮及容器內(nèi)表面材質(zhì)對極性目標物回收率的影響

分別采用圓底聚乙烯試管和玻璃試管將含有生物標志物的乙腈溶液用氮氣吹干濃縮發(fā)現(xiàn):對于極性化合物8-OHdG和6-甲氧基鳥嘌呤而言,在聚乙烯試管中濃縮得到更高的回收率,尤其是6-甲氧基鳥嘌呤,使用聚乙烯試管得到的回收率比玻璃試管高2倍;而對于極性弱的化合物如3-苯氧基苯甲酸和二溴菊酸等,試管內(nèi)表面極性的差異對其回收率無顯著影響,這可能是二氧化硅對極性強的物質(zhì)親和力較強所致。分別對樣品提取液濃縮的程度控制為“濃縮至干”和“濃縮至近干”時所得目標物回收率進行對比,發(fā)現(xiàn)提取液濃縮程度為“濃縮至近干”時得到的極性目標物回收率明顯高于“蒸干”的一組。因而樣品的濃縮選擇在圓底塑料試管中氮吹至近干。

2.2 HPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

比較了乙腈和甲醇兩種有機溶劑作為流動相的色譜和質(zhì)譜效果,發(fā)現(xiàn)乙腈作為流動相可以獲得更加尖銳的峰形。同時比較了在流動相中分別添加緩沖鹽甲酸銨和乙酸銨對色譜信號產(chǎn)生的影響,結(jié)果顯示加入甲酸銨得到的信號強度、基線平滑度和峰形尖銳度皆好于使用乙酸銨的效果。在流動相中甲酸銨濃度為0～5.0 mmol/L時,對分離效果的影響比較明顯,因而最終選擇添加5.0 mmol/L甲酸銨。經(jīng)考察,流動相的酸度對于各種生物標志物的分離也存在一定影響,流動相中添加0.1% (v/v)甲酸(pH約為3.2)時可明顯改善分離度和色譜峰形。

表 2 兔尿中8種目標化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

*y: peak area of target compound;x: mass concentration, μg/L.

2.2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以10 μL/min的速率流動注射進樣(FIA),通過一級質(zhì)譜全掃描獲得各目標化合物的分子離子峰,其中8-OHdG、6-甲氧基鳥嘌呤、5-HT、5HIAA和溴氰菊酯的分子離子為[M+H]+,二溴菊酸、3-NPA、3-PBA的分子離子為[M-H]-;進行二級質(zhì)譜掃描,分別獲得各分子離子相應(yīng)的特征子離子峰,選擇信號強度較高、干擾較小的兩個子離子作為定性定量離子。通過MRM掃描模式對去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)和碰撞室出口電壓(OP)等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化,根據(jù)得到的分子離子和特征子離子的強度峰值,確定各目標化合物最優(yōu)的MRM設(shè)置條件(見表1)。最后,用流動注射進樣模式優(yōu)化離子源溫度、霧化氣、氣簾氣等參數(shù),得到優(yōu)化后的離子源溫度、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣壓力以及正負電噴霧電壓參數(shù)分別為:550 ℃、0.31 MPa、0.207 MPa、0.369 MPa、+5 500 V和-4 500 V。

優(yōu)化后得到溴氰菊酯及其7種生物標志物的總離子流圖與選擇離子流圖分別見圖1和圖2。

圖 1 8種目標化合物標準溶液的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of standard solution of the eight target compounds Peaks: 1.6-methoxyguanine; 2. 5-HT; 3. 3-NPA; 4.8-OHdG; 5.5-HIAA; 6. deltamethrin; 7.3-PBA; 8. dibromochrysanthemic acid.

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1線性關(guān)系

配制溴氰菊酯及7種生物標志物質(zhì)量濃度分別為0、1、2、5、10、20、50、100、500 μg/L的系列混合標準溶液。將空白兔尿樣品按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述步驟進行前處理,采用溴氰菊酯及7種生物標志物質(zhì)量濃度分別為0、1、2、5、10、20、50、100、500 μg/L的系列混合標準溶液溶解殘渣,應(yīng)用1.4節(jié)HPLC-MS/MS條件進行測定,以目標組分的峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)作標準曲線,結(jié)果表明,二者在各自的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.991。

分別以信噪比(S/N≥3)和S/N≥10確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果顯示,5-HIAA的檢出限和定量限分別為20 μg/L和50 μg/L,其余化合物的檢出限均不大于5.0 μg/L,定量限均不大于10 μg/L(見表2)。

圖 2 兔尿基質(zhì)空白及空白基質(zhì)標準添加(200 μg/L)的多反應(yīng)監(jiān)測圖譜Fig. 2 MRM chromatograms of the eight target compounds in blank rabbit urine and blank rabbit urine spiked with 200 μg/L standards

2.3.2回收率與精密度

在空白兔尿中分別添加50、100、200 μg/L 3個水平的混合標準溶液進行加標回收實驗,每個水平6個平行樣,按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述步驟進行前處理,按1.4節(jié)HPLC-MS/MS條件進行測定,結(jié)果顯示,兔尿中溴氰菊酯及其生物標志物的平均回收率為74.2%～98.7%, RSD不大于12%(見表3)。

表 3 兔尿中8種目標化合物的平均加標回收率和精密度(n=6)

2.4 實際樣品測定

應(yīng)用該檢測方法對陰性空白尿液與喂毒的實驗兔子尿液等樣品進行了對比,檢測結(jié)果見表4。初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂一定劑量溴氰菊酯的兔尿中生物標志物含量與空白尿樣相比呈現(xiàn)明顯變化。其中8-OHdG、6-甲氧基鳥嘌呤、3-NPA由零檢出到升高,呈正相關(guān);5-HT和5-HIAA含量呈明顯下降狀態(tài),呈明顯負相關(guān);空白樣品中檢出二溴菊酸和3-苯氧基苯甲酸,說明空白樣品的兔飼料中原本含有溴氰菊酯殘留,隨著飼喂溴氰菊酯劑量加大,這兩種代謝物含量也明顯增加。因此推斷該“生物標志物群”可用作溴氰菊酯毒性暴露評估的指標體系。有關(guān)染毒兔組織器官病變與生物標志物含量變化之間的關(guān)系以及有關(guān)毒理評價和分析將另文發(fā)表。

表 4 兔尿樣品中8種目標化合物的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定溴氰菊酯毒性效應(yīng)的多種生物標志物的分析方法,通過對溴氰菊酯暴露動物尿液中組合生物標志物的檢測,可以了解溴氰菊酯滲透到動物組織內(nèi)部對器官、組織或細胞器造成的膜損傷、蛋白質(zhì)變性、酶失活和DNA錯誤復(fù)制等不同層次的損害。該方法操作簡單,靈敏度高,重現(xiàn)性好,可為溴氰菊酯毒性暴露評估提供可靠的技術(shù)支持。

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