李 雙, 陳樹(shù)兵, 李露青, 徐旭文,陳先鋒, 鐘鶯鶯, 張雅珩, 王傳現(xiàn)

(1. 寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211; 3. 甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心, 甘肅 蘭州 730010; 4. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海 200135)

禁限用獸藥超量和超種類(lèi)的濫用是目前食品安全所面對(duì)的重大問(wèn)題之一。近年來(lái),由于養(yǎng)殖條件差異和利益驅(qū)使,獸藥超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,激素類(lèi)殘留非常普遍,陽(yáng)性樣品檢出率逐年攀升[1,2]。原料雞養(yǎng)殖過(guò)程中所用抗生素種類(lèi)繁多,甚至抗生素停藥期不停用,使用國(guó)家禁用的地塞米松類(lèi)藥物[3]。目前,我國(guó)獸藥殘留檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)多達(dá)數(shù)十個(gè),多是按照某一類(lèi)獸藥建立的,且適應(yīng)食品基質(zhì)單一[4-7]。因此,建立食品中多獸藥的高通量篩查方法,對(duì)提高監(jiān)管工作效率、保障食品安全具有重要的意義。

獸藥檢測(cè)主要涉及兩方面技術(shù):前處理技術(shù)和儀器分析。常見(jiàn)的前處理技術(shù)包括固相萃取、固相微萃取、基質(zhì)分散固相萃取、免疫親和色譜技術(shù)、分子印跡技術(shù)、超臨界流體萃取、加速溶劑萃取等[8,9]。這些前處理技術(shù)各有特點(diǎn),但都存在選擇性限制的弊端,樣品處理通量不高。例如,于潔等[10]對(duì)16種基質(zhì)中120種獸藥同時(shí)篩查,前處理采用多次分步提取凈化步驟;張曉光等[11]檢測(cè)保健食品中的激素類(lèi)物質(zhì),用乙腈作為提取液,沒(méi)有兼容強(qiáng)極性物質(zhì)的提取;同樣地,新興的QuEChERS凈化方法也存在上述問(wèn)題,不能保證強(qiáng)極性化合物的回收率[12]。如何把極性物質(zhì)從水溶液中有效提取出來(lái),這始終是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)[13]。

隨著質(zhì)譜的發(fā)展和推廣,一次進(jìn)樣完成多類(lèi)殘留分析已成為可能。獸藥殘留正逐漸由液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)目標(biāo)型檢測(cè)向高分辨質(zhì)譜(HRMS)精確質(zhì)量非目標(biāo)型全掃描檢測(cè)轉(zhuǎn)變[14-19]。傳統(tǒng)的LC-MS/MS在定量分析上具有優(yōu)勢(shì),但分析化合物數(shù)量有限,只能針對(duì)方法中涵蓋的物質(zhì),并需要逐個(gè)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,耗時(shí)且對(duì)基質(zhì)干擾敏感,相應(yīng)的前處理也就更為復(fù)雜;而且分辨率低,不能有效區(qū)分相對(duì)分子質(zhì)量相近的化合物,會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果等。全掃描高分辨質(zhì)譜儀則不需要待測(cè)化合物的特征離子碎片,直接采集高準(zhǔn)確度質(zhì)量數(shù)(分辨率在70 000以上),對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行全掃描,需要增加目標(biāo)化合物時(shí),不必再次進(jìn)樣,重新分析已有的全掃描數(shù)據(jù)即可。在高分辨率下采集的數(shù)據(jù)降低了近似質(zhì)量數(shù)的干擾,更好地避免了假陽(yáng)性的發(fā)生。通過(guò)多級(jí)掃描,建立二級(jí)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù),特別適合高通量的檢測(cè)篩查。

本文利用載體輔助液液萃取技術(shù),通過(guò)一次前處理,涵蓋了常見(jiàn)的理化性質(zhì)差異很大的8大類(lèi)共計(jì)99種獸藥殘留的提取、凈化工作,同時(shí)結(jié)合四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜,實(shí)現(xiàn)了畜類(lèi)、禽類(lèi)、液態(tài)乳、奶粉、魚(yú)類(lèi)等動(dòng)物源性食品中常見(jiàn)獸藥殘留的一步式多殘留篩查,為提高政府監(jiān)管部門(mén)的監(jiān)管工作效率,保證動(dòng)物源性食品安全提供了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-Exactive四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司),配有H-ESI II源。液相色譜系統(tǒng)為UltiMate 3000高壓液相色譜,配有自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜柱為T(mén)hermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)。Milli-Q高純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)。冷凍干燥機(jī)(美國(guó)LABCONCO公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)。

獸藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司和德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司,純度≥95%?；|(zhì)樣品來(lái)自國(guó)家植物源性殘留監(jiān)控抽樣和進(jìn)出口送檢企業(yè)。硫酸銨、二甲基亞砜、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、氨水(均為分析純)購(gòu)自南京化學(xué)試劑一廠;色譜純甲酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為色譜純,購(gòu)自德國(guó)Merck公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(18.2 ΩM5cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈稀釋成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為3組,配制混標(biāo),第一組為28種激素類(lèi)化合物,第二組為39種磺胺喹諾酮類(lèi)化合物,第三組為32種其他獸藥;分別準(zhǔn)確吸取100 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈溶液定容至10 mL,配制10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃避光保存。

1.3 一步式提取凈化體系操作

提取液的配制:稱(chēng)取4.3 g的草酸和3.7 g EDTA,用500 mL水溶解,氨水調(diào)pH至3.0; 100 mmol/L草酸緩沖液的配制:稱(chēng)取0.9 g草酸,用90 mL水溶解,氨水調(diào)pH至5.0,加水至100 mL。

稱(chēng)取5.00 g樣品,加入5 mL提取液和15 mL乙腈,振蕩5 min, 4 500 r/min下離心5 min;取出上清液,加入1 g硫酸銨,振蕩5 min, 4 500 r/min下離心5 min,得到乙腈層(上)和水層(下);取水層上樣,平衡15 min,乙腈作為洗脫液進(jìn)行洗脫,再依次用10 mL乙腈清洗離心管2次,并依次上柱洗脫,下接50 mL離心管,并加入0.5 mL二甲基亞砜,乙腈定容至25 mL;取出12.5 mL,加入200 μL草酸緩沖液,氮吹后用純水定容至1.0 mL,過(guò)0.22 μm濾膜,高濃度的加標(biāo)水平稀釋到線性范圍內(nèi),待分析。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

液相色譜條件:色譜柱Hypersil Gold C18 (100 mm×2.1 mm 1.9 μm),部分激素成分(ESI-)的流動(dòng)相A:含有0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液;流動(dòng)相B:含有0.1% (v/v)氨水的水溶液;混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中其余成分(ESI+)的流動(dòng)相A:含有0.1%(v/v)甲酸和5 mmol/L乙酸銨的乙腈溶液,流動(dòng)相B:含有0.1%(v/v)甲酸和5 mmol/L乙酸銨的水溶液。流速:0.3 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL,梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表 1 ESI+和ESI-模式下的HPLC洗脫程序

質(zhì)譜條件:質(zhì)譜在正/負(fù)離子轉(zhuǎn)換模式下進(jìn)行全掃描測(cè)定,質(zhì)量范圍:m/z100～1 000,分辨率70 000,自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo)值5×105;部分激素成分采用負(fù)離子模式2 700 V,其余成分則采用正離子模式3 800 V,離子傳輸管溫度為300 ℃,鞘氣壓(N2)35 arb,輔助氣壓(N2)10 arb,氣化室溫度350 ℃;在樣品運(yùn)行前對(duì)儀器分別進(jìn)行正、負(fù)離子校正;二級(jí)采用自動(dòng)觸發(fā)模式,分辨率35 000, AGC目標(biāo)值2×105,碰撞能量范圍25%～40%,保留時(shí)間采集范圍:根據(jù)一級(jí)色譜圖中各個(gè)目標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間(RT)±1.00 min。

1.5 獸藥的定性、定量分析

定性分析:精確質(zhì)量誤差低于5×10-6,同時(shí)比對(duì)保留時(shí)間、同位素分布、主要二級(jí)碎片和二級(jí)質(zhì)譜圖相似度,綜合判斷后得到準(zhǔn)確定性結(jié)果,避免假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。部分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜見(jiàn)圖1。

定量分析:用3組10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液:0、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 ng/mL,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo),做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,作為待測(cè)物定量的依據(jù)。部分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在牛奶、豬肉、蝦基質(zhì)中的線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)附表1(http://www.chrom-china.com/UserFiles/File/SP1802023SI.pdf)。

圖 1 部分獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of some veterinary drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇

液體樣品或者固體水樣首先經(jīng)過(guò)強(qiáng)極性水性提取液進(jìn)行提取,可得到水溶性等強(qiáng)極性的獸藥,同時(shí)避免脂肪類(lèi)等低極性物質(zhì)的干擾。提取液中含有的EDTA也可以很好地絡(luò)合奶制品中的大量金屬離子;然后加入3倍體積的乙腈(15 mL),沉淀樣品水提液中的蛋白質(zhì)組分。乙腈溶解性好、滲透強(qiáng),已經(jīng)成為食品基質(zhì)中常用的提取溶劑,它同時(shí)可以防止極性相對(duì)偏弱的獸藥隨蛋白質(zhì)沉淀而損失。

2.2 提取劑的添加量

提取液的添加量要充分考慮柱子的填料含量,本文選擇的硅藻土柱型號(hào)為Chromabond XTR (1 000 mg),分別比較了上樣量為5、8、10、12、15 mL時(shí)的柱負(fù)載,在上樣量達(dá)到12 mL和15 mL的時(shí)候,柱已達(dá)到飽和并滲出,水溶液的滲出會(huì)導(dǎo)致最后的氮吹濃縮過(guò)程大大延長(zhǎng)。另外,當(dāng)上樣量為5 mL和8 mL的時(shí)候,柱填料未充分浸入水溶液,大大降低了柱子的利用率,同時(shí)對(duì)于獸藥本就很低的檢出限量來(lái)說(shuō),也增加了儀器檢出的難度。因此,本研究最終將上樣體積確定為10 mL。

2.3 輔助提取劑乙腈的添加量

在分級(jí)提取過(guò)程中,乙腈作為水的輔助提取劑,其加入量對(duì)不同極性獸藥的提取率有很大的影響。向液體基質(zhì)牛奶和固體基質(zhì)豬肉樣品中添加99種禁限用獸藥,通過(guò)加入不同體積(5、10、15和20 mL)的乙腈,考察乙腈添加體積對(duì)上述獸藥添加回收率的影響。

結(jié)果表明,在兩種基質(zhì)中,乙腈體積大于15 mL時(shí)的提取率趨于穩(wěn)定,均能達(dá)到60%以上?？紤]到樣品中脂肪成分的影響,最終確定其加入量為15 mL。代表性的3種獸藥阿莫西林(RT: 2.24 min)、雙氟沙星(RT: 8.03 min)和吡喹酮(RT: 24.42 min)的保留時(shí)間范圍完全涵蓋了上述99獸藥的洗脫時(shí)間。從圖2可見(jiàn),3種代表性獸藥在牛奶和豬肉中的回收率均平穩(wěn)地保持在70%以上。

圖 2 提取時(shí)乙腈體積對(duì)3種獸藥加標(biāo)回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of the acetonitrile volume during extraction on the spiked recoveries of the three veterinary drugs (n=6)

2.4 洗脫體積的優(yōu)化

洗脫液主要來(lái)自?xún)刹糠?第一部分是作為輔助提取劑的乙腈,通過(guò)加入硫酸銨使乙腈從水相提取液中分離出來(lái),得到的乙腈層位于離心管的上層,它作為水的輔助提取劑,很好地保證了弱極性獸藥的回收率。水相提取液上樣,位于離心管上層的乙腈作為洗脫液,逐級(jí)滲入,使一些強(qiáng)極性的獸藥首先從飽和的硅藻土柱上洗脫下來(lái)。第二部分的洗脫液是純乙腈,分別考查了10 mL、10 mL×2和10 mL×3乙腈作為洗脫溶劑對(duì)待測(cè)獸藥回收率的影響。同樣以代表性的3種獸藥阿莫西林、雙氟沙星和吡喹酮為例,從圖3可見(jiàn),當(dāng)乙腈體積為10 mL×2和10 mL×3時(shí),提取率趨于穩(wěn)定,3種代表性獸藥在牛奶和豬肉中的回收率均平穩(wěn)地保持在70%以上。從節(jié)約氮吹濃縮的時(shí)間和成本的角度出發(fā),確定純乙腈作為洗脫液的洗脫體積為10 mL×2。

圖 3 洗脫時(shí)乙腈體積對(duì)3種代表性獸藥加標(biāo)回收率的影響Fig. 3 Effect of the acetonitrile volume during elution on the spiked recoveries of the three veterinary drugs

2.5 液相色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本文采用UHPLC聯(lián)用高分辨臺(tái)式Q-Exactive質(zhì)譜,全掃描和正、負(fù)離子切換模式進(jìn)行測(cè)定,在MS和MS/MS模式下完成正、負(fù)極性的快速切換,通過(guò)提取一級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量,自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)，進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性,其超高的分辨率有助于解析復(fù)雜的樣品,確保Q-Exactive系統(tǒng)能夠在一次色譜運(yùn)行中最大限度地檢測(cè)和鑒定代謝物。

99種禁限用獸藥種類(lèi)和性質(zhì)差別較大,為防止在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣時(shí)不同性質(zhì)化合物發(fā)生相互反應(yīng),根據(jù)各物質(zhì)的性質(zhì)將其分為3組:第一組為28種激素類(lèi)化合物,第二組為39種磺胺喹諾酮類(lèi)化合物,第三組為32種其他獸藥。參照99種獸藥的電離性質(zhì),通過(guò)流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣,對(duì)每種獸藥的單標(biāo)溶液進(jìn)行全掃描,確定每種獸藥的電離方式和分子離子峰。其中部分激素類(lèi)化合物采用ESI-模式,其余化合物采用ESI+模式。再分別輸入各目標(biāo)化合物的分子式,由軟件計(jì)算精確分子式,可用工作站軟件自動(dòng)解析待分析樣品的質(zhì)譜掃描圖譜,綜合各種同位素豐度匹配比例、各種加合離子(如加H+、加Na+、加K+、二聚體、脫水峰、各種中性丟失),計(jì)算結(jié)果中精確質(zhì)量數(shù)對(duì)應(yīng)的可能的中性分子式組合,獲得每個(gè)化合物的分子離子峰后,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,優(yōu)化碰撞能量,獲得碎裂片段。與建立的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物的分子式、碎裂片段質(zhì)量數(shù)比較,并結(jié)合色譜保留時(shí)間,篩查是否包含數(shù)據(jù)庫(kù)中獸藥,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)獸藥的快速篩查。

在流動(dòng)相中加入0.1%(v/v)甲酸能增加正離子檢測(cè)模式下獸藥的電離效率,促進(jìn)[M+H]+離子生成,因此針對(duì)正離子模式下檢測(cè)的獸藥,添加了0.1%(v/v)甲酸。同時(shí)也進(jìn)一步考察了乙酸銨緩沖液離子強(qiáng)度的影響,乙酸銨溶液濃度從2 mmol/L變化到10 mmol/L的結(jié)果表明,以乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%(v/v)甲酸)作為流動(dòng)相時(shí)獲得了最優(yōu)的色譜峰形、分離效果和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)。相應(yīng)地,負(fù)離子模式測(cè)定的激素類(lèi)獸藥則以含0.1%(v/v)氨水的水-乙腈溶液作為流動(dòng)相。全過(guò)程選擇梯度洗脫方式,通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫條件實(shí)現(xiàn)了99種獸藥的有效分離。

另外,比較了Hypersil Gold C18色譜柱和Hypersil Gold C8色譜柱,發(fā)現(xiàn)兩柱只顯示出組分保留時(shí)間的差異,在分離度方面均可滿足質(zhì)譜檢測(cè)的需要。另外,針對(duì)2款不同規(guī)格的色譜柱(100 mm×2. 1 mm, 1.9 μm；100 mm×2.1 mm, 3 μm)進(jìn)行了比較,同樣壓力下,結(jié)果也只顯示出保留時(shí)間的極小差異。由于小粒徑色譜柱流速更低,可以很好地節(jié)約有機(jī)溶劑,因此最終選擇色譜柱為Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果的分析

各獸藥的線性范圍為0.001～0.1 μg/mL,檢出限為0.000 5～0.02 mg/kg,加標(biāo)回收率為60%～120%,標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%以?xún)?nèi)(見(jiàn)表2～表8)。

結(jié)果表明,本方法對(duì)液態(tài)乳、豬肉、魚(yú)類(lèi)等食品基質(zhì)具有較強(qiáng)的適用性,無(wú)論是脂溶性還是水溶性獸藥,都可以一步完成提取、凈化流程。

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

表 3 (續(xù))

表 4 10種紅霉素類(lèi)藥物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表 8 (續(xù))

3 結(jié)論

基于載體輔助液液萃取技術(shù),通過(guò)一次性前處理完理化性質(zhì)差異很大的常見(jiàn)8大類(lèi)共計(jì)99種獸藥殘留的提取、凈化,同時(shí)結(jié)合高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定,20 min內(nèi)可完成99種獸藥殘留的高通量篩選和確認(rèn)。高分辨率質(zhì)譜在復(fù)雜基質(zhì)樣品分析中消除了基質(zhì)的干擾,提高了定性和定量的準(zhǔn)確性,自動(dòng)觸發(fā)模式提供的二級(jí)碎片進(jìn)一步提高了定性的準(zhǔn)確性。方法的檢出限可滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)獸藥殘留限量的要求,可作為一種快速篩選和確證檢測(cè)技術(shù)廣泛使用。

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