基于灰色關(guān)聯(lián)度的當(dāng)歸及其不同藥用部位質(zhì)量評價研究

吳國霞 楊秀娟 鄧毅 陳暉 楊延澤 楊志軍

摘要：目的 以當(dāng)歸及其不同藥用部位中5個質(zhì)量指標(biāo)為依據(jù)，建立基于灰色關(guān)聯(lián)度模型的當(dāng)歸及其不同藥用部位的質(zhì)量評價模式。方法 根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》通則項下規(guī)定對當(dāng)歸及其不同藥用部位的理化檢識項目進(jìn)行測定，采用HPLC及分光光度法分別測定阿魏酸及當(dāng)歸多糖含量。結(jié)果 當(dāng)歸及其不同藥用部位樣品的相對關(guān)聯(lián)度介于0.435～0.576且比較集中，其中，全當(dāng)歸相對關(guān)聯(lián)度為0.505，當(dāng)歸尾相對關(guān)聯(lián)度為0.576，略高于當(dāng)歸身和當(dāng)歸頭樣品。結(jié)論 基于多指標(biāo)測定的灰色關(guān)聯(lián)度分析可系統(tǒng)、全面比較當(dāng)歸及其不同藥用部位的質(zhì)量，為當(dāng)歸藥用資源的高效合理利用及藥用新資源的開發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；藥用部位；灰色關(guān)聯(lián)度；質(zhì)量評價

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.017

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0077-05

Study on Quality Evaluation of Angelicae Sinensis Radix and Its Different Medicinal Parts Based on Gray Relational Analysis

WU Guo-xia1， YANG Xiu-juan1， DENG Yi1，2， CHEN Hui1， YANG Yan-ze1， YANG Zhi-jun1，2

1. College of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemical and Quality Research for Traditional Chinese and Tibetan Medicines of Gansu Province， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To establish the method of quality evaluation of different medicinal parts of Angelicae Sinensis Radix based on gray relational analysis on the basis of five quality indexes of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts. Methods According to the provisions of general rules of the People's Republic of China Pharmacopoeia 2015， the physicochemical identification items of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts were determined. The contents of ferulic acid and angelica polysaccharides were determined by HPLC and UV-Vis spectrophotometry. Results The relative degree of the samples of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts ranged from 0.435 to 0.576. The relative degree of Angelicae Sinensis Radix was 0.505， and the relative degree of tail part was 0.576， which was slightly higher than body and head parts. Conclusion The gray relational analysis based on the multi-index determination can systematically and comprehensively compare the quality of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts， and can provide the basis for the efficient use of medicinal resources and the development of new medicinal resources.

Keywords： Angelicae Sinensis Radix； different medicinal parts； gray relational analysis； quality evaluation

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，素有“十方九歸”的美譽(yù)，主產(chǎn)于甘肅，尤以甘肅岷縣所產(chǎn)品質(zhì)最優(yōu)、療效最佳、產(chǎn)量最高。當(dāng)歸有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效，主要用于血虛萎黃、

基金項目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金（81360633）；甘肅省自然科學(xué)基金（1506RJZA044）；甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題（GZK-2016-25）

通訊作者：鄧毅，E-mail：dengyi@gszy.edu.cn

眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、腸燥便秘等癥[1]。我國歷代醫(yī)家在長期臨床實踐中得出“當(dāng)歸……頭能破血，身能養(yǎng)血，尾能行血，用者不分，不如不使”（《湯液本草》）、“當(dāng)歸頭，止血而上行；身養(yǎng)血而中守；梢破血而下流；全活血而不走”（《藥性賦》）等藥性理論[2]，以當(dāng)歸身養(yǎng)血補(bǔ)血、當(dāng)歸尾行血破血為功效的相關(guān)方劑收載也多見于各類典籍。

判斷當(dāng)歸不同藥用部位間差別的基本標(biāo)準(zhǔn)包括：主要化學(xué)成分當(dāng)歸多糖、阿魏酸等含量，藥理、生化及生物分子細(xì)胞實驗指標(biāo)，以及配方后的臨床療效等指標(biāo)[3]。有研究表明，當(dāng)歸不同藥用部位不僅在外觀性狀、粉末性狀、橫切面組織結(jié)構(gòu)等方面存在顯著差異[4-5]，且在揮發(fā)油、阿魏酸、藁本內(nèi)酯等主要化學(xué)成分的含量方面也存在一定差異[6-7]；藥理學(xué)相關(guān)研究表明：當(dāng)歸所含的多糖成分是其發(fā)揮補(bǔ)血作用的主要有效成分，可以通過增加外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白等數(shù)量，改善機(jī)體造血功能[8-11]；阿魏酸為當(dāng)歸的有效成分之一，具有明顯的擴(kuò)張冠狀動脈血管、增加冠脈流量、改善心肌缺血、抑制膠原和二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集等作用[12-13]，從而具有良好的活血功效。同時測定當(dāng)歸不同藥用部位水煎液中當(dāng)歸多糖與阿魏酸含量的報道少見。本研究通過當(dāng)歸不同藥用部位的理化檢識及水煎液中主要化學(xué)成分含量測定，對當(dāng)歸不同藥用部位進(jìn)行系統(tǒng)研究，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析當(dāng)歸不同藥用部位的質(zhì)量，為當(dāng)歸的臨床合理、高效使用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

DJ-02型中藥粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司），ME204E/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），HH-S型恒溫水浴鍋（金壇市環(huán)保儀器廠），RJM-28-10型馬福爐（上海亞太儀表廠），SB-25-12-DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司），GZX-GF101-1-BS-II/H型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），MH-1000型調(diào)溫電熱套（北京科偉永興儀器有限公司），UV BlueStar B型紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科技儀器有限公司），Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司，檢測器為G1315B DAD）。

當(dāng)歸購自甘肅省岷縣清水鄉(xiāng)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李成義教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv）Diels的根，潔凈干燥后嚴(yán)格按照2015年版《中華人民共和國藥典》當(dāng)歸項下規(guī)定分為全當(dāng)歸、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸身、當(dāng)歸尾，存放于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)理化實驗室。葡萄糖對照品（批號S08J6G1）、阿魏酸對照品（批號R055F6F1），上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克公司），水為超純水，甲酸、無水乙醇等試劑均為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

2 理化檢識

2.1 總灰分測定

按照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2302項下規(guī)定進(jìn)行檢測[14]204。

2.2 酸不溶性灰分測定

按照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2302項下規(guī)定進(jìn)行檢測[14]204。

2.3 醇溶性浸出物含量測定

按照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2201項下熱浸法進(jìn)行檢測[14]202。

3 主要化學(xué)成分含量測定

3.1 測定條件

采用分光光度法測定當(dāng)歸多糖含量。樣品處理采用苯酚-硫酸法[15]，每1 mL供試品溶液加入5%苯酚1.5 mL、濃硫酸7.0 mL，沸水浴10 min后冷卻至室溫即可檢測，檢測波長為486 nm。

采用HPLC測定阿魏酸含量。色譜條件：色譜柱為Agilent A3000250×046 Pursuit 5 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A）為流動相，梯度洗脫（0～15 min，5%～15%B；15～25 min，15%～25%B；25～35 min，25%～35%B；35～40 min，35%～70%B；40～55 min，70%～95%B；55～60 min，95%～100%），檢測波長為280 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 ?L。

3.2 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品10.20 mg，置100 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，制成0.102 mg/mL葡萄糖對照品溶液，備用。

精密稱取干燥至恒重的阿魏酸對照品4.98 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，制成0.099 6 mg/mL阿魏酸對照品溶液，備用。

3.3 供試品溶液的制備

精密稱取全當(dāng)歸、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸身、當(dāng)歸尾粉末各10 g（過3號篩），加12倍量水，提取3次，提取時間2 h，濃縮各提取液至含原藥材0.5 g/mL，冷卻至室溫后精密量取各提取液1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，0.45 ?m微孔濾膜過濾，為阿魏酸供試品溶液，備用。剩余提取液加無水乙醇，使溶液最終含醇量為65%，置4 ℃冰箱中24 h充分沉淀，過濾，沉淀水浴加熱揮至無醇味后分別用乙醚、丙酮洗滌，50 ℃干燥至恒重，置100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，為當(dāng)歸多糖供試品溶液，備用。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖對照品溶液（0.102 mg/mL）0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度。分別吸取1.0 mL至干燥潔凈試管中，依次加入5%苯酚1.5 mL、濃硫酸7.0 mL，混勻，沸水浴30 min，冷卻至室溫后，以第一管為空白對照，于486 nm波長處測定吸光度（A），以葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，葡萄糖在0.010 2～0.102 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：A=11.360C-0.004 0，r=0.999 6。

精密吸取阿魏酸對照品溶液（0.099 6 mg/mL）5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 ?L，按“3.1”項下色譜條件進(jìn)行含量測定，以阿魏酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（T）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，阿魏酸在0.498～2.988 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：T=2763C+30.65，r=1。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 穩(wěn)定性試驗

精密量取葡萄糖對照品溶液和當(dāng)歸多糖供試品溶液各1.0 mL，按“3.1”項下當(dāng)歸多糖測定方法操作，在486 nm波長處測定吸光度，前60 min每隔10 min測定1次，后60 min每隔20 min測定1次，結(jié)果葡萄糖對照品溶液吸光度值RSD=0.51%，當(dāng)歸多糖供試品溶液吸光度值RSD=0.62%，表明葡萄糖對照品溶液及當(dāng)歸多糖供試品溶液在120 min內(nèi)保持穩(wěn)定。

精密吸取阿魏酸對照品溶液和阿魏酸供試品溶液各20 ?L，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果相對峰面積RSD=1.23%，表明穩(wěn)定性良好。

3.5.2 精密度試驗

精密吸取葡萄糖對照品溶液1 mL，共6份，在486 nm波長處測其吸光度，RSD=1.9%，結(jié)果表明精密度良好。

精密吸取阿魏酸對照品溶液20 ?L，在“3.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，相對峰面積RSD=0.27%，表明精密度良好。

3.5.3 加樣回收率試驗

稱取等量全當(dāng)歸粉末各5份，分別加入一定質(zhì)量的葡萄糖對照品，按“3.3”項下方法制備葡萄糖供試品溶液，并按“3.1”項下條件測定，結(jié)果平均加樣回收率為101.21%，RSD=1.96%。

稱取全當(dāng)歸粉末3.00 g各5份，分別加入一定質(zhì)量的阿魏酸對照品，按“3.3”項下方法制備阿魏酸供試品溶液，并按“3.1”項下條件測定，結(jié)果平均加樣回收率為98.71%，RSD=1.23%。

3.6 樣品測定

精密量取1 mL當(dāng)歸多糖供試品備用液，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，按“3.1”項下當(dāng)歸多糖測定條件操作，測定其吸光度。

分別精密吸取全當(dāng)歸、當(dāng)歸頭、當(dāng)歸身、當(dāng)歸尾的阿魏酸供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣量20 ?L，各樣品溶液HPLC圖譜中阿魏酸的保留時間基本一致，均為20 min左右。根據(jù)阿魏酸成分的峰面積計算阿魏酸含量。

注：D1.阿魏酸對照品；D2.全當(dāng)歸；D3.當(dāng)歸頭；D4.當(dāng)歸身；D5.當(dāng)歸尾

圖1 當(dāng)歸不同藥用部位水煎液HPLC圖

4 評價當(dāng)歸及其不同藥用部位質(zhì)量灰色關(guān)聯(lián)度模式的建立

4.1 灰色關(guān)聯(lián)度法的建立

4.1.1 參考序列的選擇

設(shè)有m個藥材樣品，每個藥材樣品有n項評價指標(biāo)，則可組成評價單元序列{Xak}（a=1，2，3，…，m；k=1，2，3，…，n；本研究中m=4，n=5）。從質(zhì)量評價角度分析，醇浸出物、當(dāng)歸多糖、阿魏酸含量越高質(zhì)量越好，灰分、酸不溶性灰分含量越低質(zhì)量越好。為了統(tǒng)一評價標(biāo)準(zhǔn)，采用將低樣品對應(yīng)優(yōu)指標(biāo)高優(yōu)化的方法[16]。用灰色關(guān)聯(lián)度作為評價測度時，試驗將總灰分和酸不溶性灰分含量進(jìn)行取倒數(shù)轉(zhuǎn)換。評價指標(biāo)統(tǒng)一后，設(shè)最優(yōu)參考序列的各項指標(biāo)是n個指標(biāo)的最大值，記為{Xsk}=max{1≤s≤m}{Xik}，最差參考序列的各項指標(biāo)是m個樣品對應(yīng)指標(biāo)的最小值，記為{Xtk}=min{l≤t≤m}{Xik}。

4.1.2 原始數(shù)據(jù)規(guī)格化處理

如果原始數(shù)據(jù)量綱不統(tǒng)一，則需要對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行變換處理。以均值化變換最常用，公式為：Yik=Xik/Yk（Yik為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Yk為第m個樣品的第k個指標(biāo)的均值）[17]。

4.1.3 關(guān)聯(lián)度計算

用灰色關(guān)聯(lián)度進(jìn)行評價時，應(yīng)選擇其參考序列。最優(yōu)參考序列和最差參考序列分別為{Xsk}和{Xtk}（k=1，2，3，…，n）。設(shè)最優(yōu)參考序列的各項指標(biāo)是n個樣品對應(yīng)指標(biāo)的最大值，即{Xsk}；最差參考序列的各項指標(biāo)是n個樣品對應(yīng)指標(biāo)的最小值，即{Xtk}。按公式（1）（2）計算各評價單元序列相對最優(yōu)（差）參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。按公式（3）（4）計算各評價單元相對于最優(yōu)（差）參考序列的關(guān)聯(lián)度。

ε_k（s）^i=（Δmin+ρΔmax）/（|Y_ik-Y_sk |+ρΔmax） （1）

ε_k（t）^i=（Δ^' min+ρΔ^' max）/（|Y_ik-Y_sk |+ρΔ^' max） （2）

式中：Δmin=min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|，Δ′min=min|Yik-Ytk|，Δ′max=max|Yik-Ytk|；ρ為分辨系數(shù)，一般取值0.5。

（3）

（4）

4.1.4 相對關(guān)聯(lián)度的計算

如果評價單元與最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)程度最大而同時與最差參考序列的關(guān)聯(lián)程度最小，則說明所評價的序列越理想，為最佳評價單元。由此將評價單元序列同時相對于最優(yōu)參考序列和最差參考序列的相對關(guān)聯(lián)度定義為公式（5），根據(jù)相對關(guān)聯(lián)度的大小對評價單元序列進(jìn)行排序，最終得到評價結(jié)果。

（5）

4.2 樣品數(shù)據(jù)的建立

測定當(dāng)歸及其不同藥用部位的總灰分和酸不溶性灰分、醇浸出物、當(dāng)歸多糖、阿魏酸含量5個主要評價指標(biāo)，計算各成分的百分含量，建立評價當(dāng)歸及其不同藥用部位質(zhì)量的灰色模式識別數(shù)據(jù)集，結(jié)果見表1、表2。將原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行規(guī)格化處理，結(jié)果見表3。分別由公式（1）（2）（3）（4）計算各評價單元相對于最優(yōu)、最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)及關(guān)聯(lián)度，結(jié)果見表4～表7。由公式（5）計算當(dāng)歸及其不同藥用部位樣品的相對關(guān)聯(lián)度并排序，得出不同部位的質(zhì)量名次，結(jié)果見表8。

4.3 當(dāng)歸及其不同藥用部位藥材質(zhì)量評價

相對關(guān)聯(lián)度越大，該樣品的質(zhì)量評價越高，當(dāng)歸及其不同藥用部位藥材樣品的相對關(guān)聯(lián)度介于0.435～0.576。其中相對關(guān)聯(lián)度>0.50的為當(dāng)歸尾、全當(dāng)歸，其藥材質(zhì)量評價較高；當(dāng)歸頭、當(dāng)歸身的相對關(guān)聯(lián)度<0.50，質(zhì)量評價較低。各樣品質(zhì)量評價依次為當(dāng)歸尾>全當(dāng)歸>當(dāng)歸身>當(dāng)歸頭，當(dāng)歸尾樣品中指標(biāo)相對關(guān)聯(lián)度最大（0.576），質(zhì)量評價最優(yōu)，其次為全當(dāng)歸樣品（0.505），當(dāng)歸頭相對關(guān)聯(lián)度最小（0.435），其質(zhì)量評價較差。

5 討論

本研究首先對當(dāng)歸及其不同藥用部位進(jìn)行總灰分、酸不溶性灰分及浸出物的檢測，結(jié)果表明，所選樣品均符合《中華人民共和國藥典》要求?；曳旨八岵蝗芑曳趾恳来螢椋寒?dāng)歸尾>全當(dāng)歸>當(dāng)歸身>當(dāng)歸頭；浸出物含量依次為：當(dāng)歸頭>當(dāng)歸尾>當(dāng)歸身>全當(dāng)歸，當(dāng)歸不同部位醇溶性浸出物含量明顯高于全當(dāng)歸，這種量的變化對于當(dāng)歸不同提取部位的研究有重大意義。同時測定了當(dāng)歸及其不同藥用部位水煎液中當(dāng)歸多糖、阿魏酸的含量，結(jié)果表明：當(dāng)歸多糖含量以當(dāng)歸身顯著高于其他部位；而阿魏酸含量則以當(dāng)歸尾顯著高于其他部位。結(jié)合上述當(dāng)歸多糖為當(dāng)歸補(bǔ)血的主要物質(zhì)基礎(chǔ)、阿魏酸為當(dāng)歸活血的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，表明當(dāng)歸“身養(yǎng)血，尾行血，全能補(bǔ)血活血”的藥性理論古今一致，且與文獻(xiàn)中描述的組織形態(tài)鑒定結(jié)果相吻合[18]。

目前多用顯微模式識別、化學(xué)指紋圖譜、化學(xué)計量法等方法評價中藥材的質(zhì)量。當(dāng)歸作為一種傳統(tǒng)中藥材，具有化學(xué)成分復(fù)雜、成分與質(zhì)量有一定模糊性等特點(diǎn)，可視為一個灰色系統(tǒng)。本試驗建立的灰色關(guān)聯(lián)度模型，以總灰分及酸不溶性灰分含量的倒數(shù)、醇溶性浸出物含量、水煎液當(dāng)歸多糖含量、水煎液阿魏酸含量為參評項目，以相對關(guān)聯(lián)度為評價指標(biāo)，對當(dāng)歸及其不同藥用部位藥材質(zhì)量實現(xiàn)了多成分、多指標(biāo)的優(yōu)劣評價，與建立在多元統(tǒng)計分析基礎(chǔ)上的統(tǒng)計模式識別相比，具有較大的優(yōu)越性，能夠客觀地反映不同藥用部位的內(nèi)在質(zhì)量，可為當(dāng)歸不同藥用部位的質(zhì)量評價提供新思路。

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（收稿日期：2017-06-22）

（修回日期：2017-07-09；編輯：陳靜）