李 丹，王鶴佳，張玉潔，沈 昕，李 倩

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，北京 100081)

氨基比林(Aminopyrine)、安替比林(Antipyrine)和安乃近(Dipyrone，or Metamizole Sodium)為臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，屬于吡唑酮類解熱鎮(zhèn)痛藥[1]。其中，氨基比林是在安替比林的分子中引入二甲氨基得到，安乃近是在氨基比林的結(jié)構(gòu)中引入水溶性的亞甲基磺酸鈉得到。安乃近在體內(nèi)可迅速水解成活性產(chǎn)物4-甲氨基安替比林(MAA)，特別是經(jīng)首過作用后，幾乎全部轉(zhuǎn)變成MAA，再進入體循環(huán)，其藥理作用主要由MAA產(chǎn)生[2]。這類藥物的不良反應(yīng)主要包括粒細胞減少、再生障礙性貧血、嚴重的過敏反應(yīng)和休克虛脫等[3-4]。在獸醫(yī)領(lǐng)域，這些藥物主要作為一些嚴重疾病的輔助對癥藥物。由于其解熱鎮(zhèn)痛療效確切，價廉易得，經(jīng)常被長期過量使用，且由于不嚴格遵守休藥期等原因，容易在動物體內(nèi)產(chǎn)生蓄積殘留，進而危害人類的生命健康。為加強獸藥殘留監(jiān)控，保證動物性食品衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定安乃近的殘留標(biāo)示物為4-甲氨基安替比林(MAA)，在豬的肌肉組織中的最高殘留限量(MRL)為200 μg/kg[5]，歐洲藥品管理局規(guī)定食源動物豬的肌肉中安乃近的最高殘留限量為100 μg/kg[6](以MAA為殘留標(biāo)示物計算)。

由于氨基比林、安替比林和安乃近均為獸醫(yī)臨床最廣泛使用的三種解熱鎮(zhèn)痛藥，且結(jié)構(gòu)極為類似。目前，國內(nèi)外關(guān)于測定羊肉、牛肉、豬肉中安乃近代謝物的LC-MS/MS法、HPLC法等已有報道[7-9]，但采用高效液相色譜法同時測定豬肉中氨基比林、安替比林、安乃近殘留的檢測方法尚未見報道。本研究旨在建立一種操作步驟簡單，并可滿足同時檢測豬肉中氨基比林、安替比林、安乃近殘留的檢測方法，從而使方法的普適性更好。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品、主要試劑及其配制 安替比林對照品：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量≥99.9%；氨基比林對照品：中國食品藥品檢定研究院，含量≥99.9%；4-甲氨基安替比林對照品：中國食品藥品檢定研究院，含量≥96.6%。乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國Fisher公司；無水硫酸鈉(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氨水、甲酸，北京化工廠。水：美國Millipore超純水儀制備，符合GB/T 6682-1992規(guī)定的一級水。

氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL)：分別稱取氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林對照品約10 mg，精密稱定，于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20 ℃保存。

氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 μg/mL)：準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇溶解并稀釋成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ℃保存。

1.2 主要儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，美國安捷倫公司；AE 240型分析天平； Biofuge Stratos高速冷凍離心機，德國賀利氏公司；IKEA渦動混合儀；IKA-WERKE振蕩器；MCX固相萃取柱：60mg/3mL。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取 稱取(5±0.05)g試料，置50 mL離心管中，乙腈8 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，殘渣再用乙腈8 mL，提取一遍，合并兩次提取液，加無水硫酸鈉4 g，10000 r/min離心5 min，上清液再轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，于40 ℃水浴下氮氣吹至近干。加2%甲酸水溶液5 mL溶解，備用。

1.3.2 樣品的凈化 MCX柱用甲醇3 mL、2%甲酸水3 mL預(yù)洗。取備用液過柱，用2%甲酸水、甲醇各3 mL淋洗，擠干，5%氨化甲醇5 mL洗脫， 于40 ℃水浴下氮氣吹干。加流動相1.0 mL，混勻，過濾膜，供高效液相色譜法測定。

1.3.3 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱: Phenomenex Luna C18 250 mm×4.6 mm (i.d)，粒徑5 μm，或相當(dāng)者；流動相為乙腈-水(20+80,V/V)；流速1.0 mL/min；檢測波長265 nm；柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確量取適量氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動相稀釋成濃度分別為50、100、200、500、1000、2000 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將此系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次從低濃度到高濃度按液相色譜條件進行分析，每一濃度進樣三次，按其所得三次峰面積的平均值與對應(yīng)的對照溶液的質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 回收率及精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，稱取勻漿后的組織樣品，置于50 mL離心管中，添加適宜濃度的氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使豬肉中的藥物濃度分別為20、100、400 μg/kg。每種濃度5個樣品，重復(fù)3批次，按照1.3.1項和1.3.2項的方法處理后，供HPLC測定，外標(biāo)法定量，計算回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.3.6 檢測限和定量限的測定 對氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林標(biāo)準(zhǔn)工作液，進行HPLC分析，并逐漸降低氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的濃度，以溶液檢測時的信噪比(S/N)分別大于等于3和10作為藥物的檢測限和定量限，并計算定量限濃度點的回收率及批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗證其可靠性[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測得豬肉中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林色譜峰峰形好，峰間隔時間較長，且均達到基線分離?？瞻捉M織樣品在上述時間無干擾峰出現(xiàn)(圖1)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別以氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的色譜峰面積與其對應(yīng)的對照溶液的質(zhì)量濃度做圖，得到氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在20～400 μg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

A. 氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林500 μg·L-1對照溶液色譜圖(1. Antipyrine ,2. 4-methylaminoantipyrine ,3.Aminopyrine)A. Chromatogram of Aminopyrine , Antipyrine and 4-methylaminoantipyrine 500 μg·L-1reference solution

B.豬肉組織空白色譜圖B. Chromatogram in blank pig muscle

C. 豬肉組織中添加100 μg/kg氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林藥物色譜圖C. Chromatogram of Aminopyrine , Antipyrine and 4-methylaminoantipyrine 100 μg·kg-1 added in pig muscles(1. Antipyrine ,2. 4-methylaminoantipyrine ,3.Aminopyrine)圖1 豬肉中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC Chromatogram of Aminopyrine , Antipyrine and 4-methylaminoantipyrine in pig muscles

藥物Drug 線性范圍/(μg·L-1)Linear range回歸方程Standard curve equation相關(guān)系數(shù)rCorrelation coefficient氨基比林50～2000 y=0.0465x-1.17360.9998安替比林50～2000 y=0.0567x-1.24240.99984-甲氨基安替比林50～2000 y=0.0437x-0.92280.9996

2.3 樣品的回收率及精密度 由表2可以看出，豬肉組織中添加濃度水平分別為20、100、400 μg/kg時，氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的平均回收率分別在71.1%～85.1%、71.8%～78.9%、70.7%～83.6%范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間的RSD分別低于10.6%、10.9%。結(jié)果表明該方法可靠，重復(fù)性高。

表2 豬肉中添加氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的回收率測定結(jié)果(n=5)Tab 2 Recovery rate and precision of the drugs added in pig muscles

2.4 靈敏度 應(yīng)用本試驗建立的檢測方法，測得豬肌肉組織中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的檢測限、定量限分別為6 μg/kg(S/N≥3)、20 μg/kg(S/N≥10)。由表2可見，添加濃度為20 μg/kg時，氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在豬肌肉組織中的平均回收率均大于71.1%，批內(nèi)、批間的RSD分別低于10.6%、10.9%。表明該方法在定量限水平的可靠性好，且靈敏度高，完全滿足氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在豬肌肉組織中殘留檢測的需要。

3 討論與小結(jié)

3.1 儀器條件的優(yōu)化 色譜條件的優(yōu)化過程中，對流動相的種類及比例進行了考察，采用乙腈-水較甲醇-水的分析時間短，峰形好。調(diào)整流動相比例，發(fā)現(xiàn)乙腈-水比例為20∶80時，分析時間控制在20 min內(nèi)，且三種目標(biāo)化合物均達到完全分離。因此，流動相確定為乙腈-水(20∶80，V/V)。

3.2 提取溶劑的選擇 在研究過程中，對樣品的提取溶劑進行了實驗摸索。采用乙腈、甲醇、硫酸鈉+亞硫酸鈉溶液分別進行提取實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種藥物經(jīng)乙腈提取，效果非常理想，對不同濃度的添加實驗其回收率均高于70%，達到了殘留檢測的要求，因此，確立乙腈作為提取液。

3.3 樣品提取與凈化方法的優(yōu)化 參考文獻的方法對豬肌肉組織中的氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林進行了提取實驗，但效果不理想，干擾雜質(zhì)太多，達不到基本分離的要求，因此，樣品經(jīng)乙腈提取后，加入了無水硫酸鈉進行鹽析去雜質(zhì)，并對無水硫酸鈉加入的先后進行了對比實驗，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無水硫酸鈉與乙腈一起加入進行提取，樣品溶液中雜質(zhì)干擾依然很大，分離效果不太理想，但樣品經(jīng)乙腈提取完成后再加入無水硫酸鈉進行凈化，測定結(jié)果顯示三種藥物的回收率高，且均達到良好分離。實驗過程中采用液-固提取的方法，對MAX、MCX、PCX、C18等不同類型的固相萃取柱進行摸索，結(jié)果表明三種藥物經(jīng)MCX柱凈化后回收率最高。因此，本實驗采用加入無水硫酸鈉和MCX柱對樣品進行凈化。在進一步摸索洗脫條件時，比較了2%、5%、10%氨化甲醇的洗脫效果，結(jié)果表明5%氨化甲醇的洗脫能力最強，效果最好。因此，確立5%氨化甲醇作為洗脫溶液。

3.4 回收率及靈敏度 試驗中氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林的添加濃度范圍為20～400 μg/kg時，回收率在70.7%～85.1%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間RSD分別低于10.6%、10.9%，符合農(nóng)業(yè)部對獸藥殘留試驗規(guī)范中的要求[11]。通過添加定量限濃度點對其可靠性進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在豬肉中的回收率均大于71.1%，批內(nèi)、批間的RSD分別低于10.6%、10.9%。該方法在定量限水平的可靠性好，且靈敏度高，完全滿足氨基比林、安替比林、4-甲氨基安替比林在豬肉中殘留檢測的需要。

本研究建立了一種同時檢測豬肉氨基比林、安替比林及安乃近代謝物的多殘留分析方法，該方法靈敏可靠，完全滿足豬肉中氨基比林、安替比林及安乃近代謝物的殘留檢測要求。

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