不同樹(shù)葉凋落物對(duì)人參土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

孫 海,王秋霞,張春閣,李 樂(lè),劉政波,劉 寧,邵 財(cái),張亞玉,*,嚴(yán) 珺,李躍雄

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所, 長(zhǎng)春 130112 2 上海上藥神象健康藥業(yè)有限公司, 上海 200336

人參(PanaxginsengC.A. meyer)為五加科多年生草本植物,是大宗名貴中藥材。目前主要有農(nóng)田栽培和林下護(hù)育兩種生產(chǎn)模式,而林下護(hù)育人參是一種仿野生護(hù)育的高品質(zhì)人參,具有人為干擾少、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)的特點(diǎn)使其生長(zhǎng)若干年后具備一定的野山參外部形態(tài)和內(nèi)在品質(zhì)特征,2015版藥典正式將林下護(hù)育人參定義為“林下山參”。研究發(fā)現(xiàn)林下山參存苗率、紅皮病發(fā)病率、根的形態(tài)建成及品質(zhì)形成與其生長(zhǎng)的森林生態(tài)環(huán)境條件密不可分[1- 4]。

土壤特性、伴生樹(shù)種、海拔高度、坡度等多個(gè)因素影響人參皂苷積累和參根形態(tài)結(jié)構(gòu)建成。土壤特性直接影響人參生長(zhǎng)發(fā)育,而伴生樹(shù)種是影響土壤的重要因素,這是因?yàn)?1)：樹(shù)種凋落物是森林土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的主要補(bǔ)給途徑,同時(shí)也是植物——土壤間碳氮循環(huán)的重要途徑[5- 6]；凋落物作為土壤有機(jī)質(zhì)地上部分的主要來(lái)源,其輸入的數(shù)量和質(zhì)量變化可能改變土壤中碳的積累或流失狀況,不同生產(chǎn)模式下人參土壤肥力研究表明野山參土壤有機(jī)質(zhì)含量是農(nóng)田栽參土壤的10倍以上[7- 9],且在大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)內(nèi),由土壤供給植物所需要的養(yǎng)分中超過(guò)90%的氮和磷以及超過(guò)60%的其他礦質(zhì)元素均來(lái)自于凋落物的分解[10]。(2)不同的樹(shù)種凋落物中含有不同的碳源和氮源,驅(qū)使土壤微生物集群定向進(jìn)化,進(jìn)而改變土壤肥力[11]。如北方針葉林森林生態(tài)系統(tǒng),土壤礦化層和凋落物重含有大量不易被微生物利用的木質(zhì)素和腐殖酸,由于碳源的影響,土壤微生物集群以分解復(fù)雜結(jié)構(gòu)有機(jī)碳為主[12]。另外,不同凋落物土壤pH值和C/N是影響微生物集群定向進(jìn)化的重要因素[13]。許多研究已經(jīng)證實(shí)樹(shù)種凋落物對(duì)于增加土壤中微生物量碳氮、提高土壤養(yǎng)分、改變土壤微環(huán)境具有重要意義[14-15]。

大量研究表明樹(shù)種凋落物影響土壤養(yǎng)分釋放、生物地球化學(xué)過(guò)程以及微生物生態(tài)組成[16-17]。土壤微生物群落是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要生物成分,其結(jié)構(gòu)和功能多樣性與土壤功能關(guān)系密切,在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要角色,如氮循環(huán)、有機(jī)質(zhì)礦質(zhì)化、土壤有機(jī)碳的保存和釋放,以及對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng)[18-20]。特定的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)于穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)和維持土壤生態(tài)功能至關(guān)重要[21],鑒于土壤微生物對(duì)于土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的重要性,目前農(nóng)田栽參連作障礙、林下山參土壤抗逆境脅迫能力以及林下山參根形態(tài)建成等方面研究均聚焦在土壤微生物多樣性[22-23]。利用磷脂脂肪酸方法研究發(fā)現(xiàn)林下山參土壤中微生物生物量(670.64 nmol/g)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于農(nóng)田栽參土壤(266.80 nmol/g),其中林下山參土壤中有益微生物菌群(放線菌)含量是農(nóng)田栽參的3.86倍；同時(shí)在林下山參土壤中發(fā)現(xiàn)代表抗逆性微生物藍(lán)細(xì)菌(18:2ω6),而農(nóng)田栽參土壤未檢出[24]。由此可見(jiàn),林下山參能夠健康在同一地點(diǎn)生長(zhǎng)十幾年甚至幾十年不感病與其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

人參品質(zhì)形成受其生長(zhǎng)的土壤環(huán)境影響,而林下山參品質(zhì)優(yōu)劣往往與其護(hù)育的森林生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。選林是林下山參護(hù)育第一步,也是林下山參護(hù)育成敗所在。為了進(jìn)一步研究不同樹(shù)葉凋落物對(duì)土壤性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響,本研究以添加不同樹(shù)葉凋落物人參土壤為研究對(duì)象,利用16S 和ITS測(cè)序技術(shù)研究不同土壤凋落物對(duì)人參土壤養(yǎng)分、微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響,旨在為林下山參護(hù)育選擇林地和農(nóng)田栽參土壤改良提供理論科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 盆栽土壤和樹(shù)葉的收集

盆栽土壤和樹(shù)葉收集地點(diǎn)選在林下山參主產(chǎn)區(qū)吉林省撫松縣楞場(chǎng)村吳杰林下山參護(hù)育基地(127°75′78″E, 42°81′12″N),收集時(shí)間為2014年10月。盆栽土壤取至基地旁邊廢棄3 a的農(nóng)田土,收集20 cm深土壤并過(guò)0.9 mm篩備用,供試土壤pH 5.89,有機(jī)碳為20.89 g/kg,堿解氮161.32 mg/kg,有效磷25.83 mg/kg,速效鉀為220.54 mg/kg。同時(shí)在林下山參基地收集色木槭、赤松、胡桃楸、紫椴和蒙古櫟的落葉,收集到的樹(shù)葉在35 ℃下烘至恒重并過(guò)0.01 mm篩備用,不同樹(shù)葉凋落物的各元素含量見(jiàn)表1。

表1 供試樹(shù)葉凋落物各元素含量

色木槭Acermono. Maxim. var. mono;赤松PinusdensifloraSieb. et Zucc;胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim;紫椴TiliaamurensisRupr.; 蒙古櫟QuercusmongolicaFisch. ex Ledeb

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及土壤樣品準(zhǔn)備

盆栽試驗(yàn)按照6個(gè)處理3次重復(fù),采用完全隨機(jī)區(qū)組方法設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)于2013年10月布置在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。樹(shù)葉添加量按照張新平[25]調(diào)查方法,連續(xù)3 a調(diào)查吳杰林下山參基地單位面積落葉量,最終確定盆栽土壤樹(shù)葉加入量為5.0 g/3.5 kg(樹(shù)葉/干土),本試驗(yàn)6個(gè)處理分別為：A：色木槭Acermono. Maxim. var. mono(5.0 g)、B：赤松PinusdensifloraSieb. et Zucc.(5.0 g)、C：胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim.(5.0 g)、D:紫椴TiliaamurensisRupr.(5.0 g)、E：蒙古櫟QuercusmongolicaFisch. ex Ledeb.(5.0 g)、F：對(duì)照(不添加樹(shù)葉凋落物),其中色木槭、胡桃楸、紫椴和蒙古櫟為闊葉林樹(shù)種,赤松為針葉林樹(shù)種。不同樹(shù)葉凋落物風(fēng)干后,粉碎過(guò)60目篩后與土壤充分混勻作為供試土壤,挑選大小一致的3 a生人參苗5株種植在黑色的PVC營(yíng)養(yǎng)缽里(直徑為120 mm,高度為180 mm),每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽作為一個(gè)重復(fù)。盆栽溫度在17—28 ℃之間,相對(duì)濕度在70%—80%之間,所有的處理每周澆一次水,每次每盆1 L水。

2014年3月盆栽人參一個(gè)生育期結(jié)束,收集每株人參根區(qū)20 g土壤,并將每盆中5株人參根區(qū)土壤混合作為一個(gè)重復(fù)。所有處理土壤樣品過(guò)2.0 mm篩,一部分自然風(fēng)干用作土壤理化分析,另一部分轉(zhuǎn)移至-80 °C冰箱中用作DNA提取。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

土壤pH值按照土水比1∶2.5比例,采用梅特勒SK 220 pH計(jì)測(cè)定,土壤有機(jī)碳、全氮利用德國(guó)產(chǎn)元素分析Vario EL Ⅲ測(cè)定[26],堿解氮采用培養(yǎng)皿擴(kuò)散法測(cè)定,速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色測(cè)定,有效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法測(cè)定,具體測(cè)定方法參見(jiàn)土壤農(nóng)化分析[27]；土壤微生物碳和氮利用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法[28],利用總有機(jī)碳分析儀(Vario TOC,德國(guó))測(cè)定提取液中有機(jī)碳含量,用連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3,德國(guó)) 測(cè)定總氮含量。測(cè)定結(jié)果分別乘以校正系數(shù)KEC 0.45和KEN 0.54,即為土壤中微生物量碳氮含量。

1.4 DNA提取和擴(kuò)增

DNA提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g土樣,按照MoBio強(qiáng)力土壤微生物DNA提取試劑盒(Power SoilTM DNA IslationKit, MoBio, USA)說(shuō)明書(shū)步驟,分別提取不同樹(shù)葉處理的3個(gè)重復(fù)土樣總DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA完整性、Mini Dorp測(cè)定DNA純度和濃度。提取的DNA于-20 ℃保存、備用。

擴(kuò)增：細(xì)菌和真菌核糖體編碼基因相應(yīng)區(qū)段的擴(kuò)增及測(cè)序服務(wù)由諾禾致源生物信息公司完成。細(xì)菌多樣性的測(cè)定參考Caporaso等[29]的方法,擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)段,引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。真菌多樣性采用ITS1區(qū)段進(jìn)行測(cè)序分析。引物為ITS5- 1737F (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)。DNA擴(kuò)增條件為98 ℃預(yù)變性1 min,98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。測(cè)序采用Illumina MiSeq平臺(tái)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

所測(cè)得原始序列截去Barcode序列和引物序列后,經(jīng)FLASH拼接獲得原始 Tags數(shù)據(jù)。原始Tags經(jīng)QIIME過(guò)濾處理獲得高質(zhì)量Tags 數(shù)據(jù)(CleanTags),并與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列,最終獲得有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。以97%相似性為依據(jù),利用UPARSE pipeline軟件(V7.0.1001)將各序列聚類(lèi)成為OTUs。為獲得土壤樣品中微生物物種的多樣性信息,使用cluster軟件對(duì)所得序列進(jìn)行聚類(lèi),并利用RDP classifier(V2.2)軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋,統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在各分類(lèi)水平上的構(gòu)成。

相關(guān)性分析采用SAS 9.0軟件處理,圖片利用Excel 2013和CANOCO 5.0制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤性質(zhì)

不同樹(shù)葉處理的3年生人參經(jīng)過(guò)一個(gè)生育期后,土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)如表2。添加樹(shù)葉處理的土壤(處理A、B、C、D和E)pH值均高于對(duì)照(F)土壤pH值5.91(P<0.05)。不同處理下土壤容重由對(duì)照0.96 g/cm3分別降低至處理A 0.90 g/cm3、處理C 0.95 g/cm3、處理D 0.94 g/cm3及處理E 0.95 g/cm3。添加不同樹(shù)葉后土壤有機(jī)碳和全氮含量變化范圍分別為20.20—28.90 g/kg和2.20—4.11 g/kg。不同樹(shù)葉處理C/N顯著低于對(duì)照(P<0.05),而微生物量碳氮、速效氮磷含量顯著增加,其中處理A、B和C土壤微生物量碳含量高于處理D、E,處理E中微生物量氮含量最高,處理A、D、C、B中微生物量氮含量依次降低,但均顯著高于對(duì)照(F)(P<0.05)。

表2 土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)

色木槭Acermono. Maxim. var. mono;赤松PinusdensifloraSieb. et Zucc;胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim;紫椴TiliaamurensisRupr.; 蒙古櫟QuercusmongolicaFisch. ex Ledeb; F：對(duì)照; 表中數(shù)值為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3),同一行不同小寫(xiě)字母表示不同處理在0.05水平下達(dá)到顯著差異水平

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的基本分析

以不同樹(shù)葉處理的18個(gè)人參土壤樣品為研究對(duì)象,16S rDNA測(cè)序得到1478922個(gè)reads,而ITS1測(cè)序得到1250222個(gè)reads。以97%相似性為依據(jù),過(guò)濾處理獲得高質(zhì)量序列,其中16S rDNA分析共得到1367082條序列,單個(gè)土壤樣品中變化范圍為從29572條至236044條,而ITS1分析中共得到761544條序列,單個(gè)土壤樣品變化范圍從22725條至129253條,以上序列被保留用作進(jìn)一步分析。所有樣品16S rDNA測(cè)序一共得到6064個(gè) OTUs,不同樣品OTU數(shù)目變化范圍為2890至4750,ITS1測(cè)序一共得到1990個(gè)OTUs,不同樣品OTU數(shù)目變化范圍為480至1370。

在16S rDNA所有序列中,其中27342條(2%)為沒(méi)有分類(lèi)的序列,其余的序列在門(mén)的水平上由大到小依次為Protecbacteria(41%)、Acidobacteria(18%)、Actinobacteria(14%)、Gemmatimonadetes(8%)、Chloroflexi(5%)、Crenarchaeota(3%)、Nitrospirae(3%)、Firmicutes(2%)、Verrucomicrobia(2%)及Bacteroidetes(2%)(圖1a)。在綱的水平共鑒定117綱,大于1%的序列共19個(gè),從大到小依次為Alphaproteobacteria(18.07%,13.99%—21.03%)、Acidobacteria- 6(18.07%,9.53%—12.35%)、Betaproteobacteria(9.11%,8.56%—9.49%)、Deltaproteobacteria(7.69%,7.11%—7.99)、Actinobacteria(6.72%,6.58%—7.66%)、Gammaproteobacteria(5.90%,5.38%—6.48%)、Gemmatimonadetes(4.68%,4.21%—5.51%)、Acidimicrobiia(3.23%,2.94%—3.57%)、Chloracidobacteria(2.97%,2.71%—3.36%)、Thaumarchaeota(2.88%,2.25%—3.73%)、Gemm- 1(2.79%,2.57%—3.15%)、Nitrospira(2.65%,2.33%—2.85%)、Thermoleophilia(2.31%,2.00%—2.59%)、Ellin6529(2.15%,1.97%—2.29%)、Sphingobacteriia(2.06%,1.76%—2.34%)、Solibacteres(2.01%,1.72%—2.19%)、Bacilli(1.42%,0.61%—2.13%)、[Spartobacteria] (1.26%,0.94%—1.61%)和MB-A2- 108(1.10%,0.91%—1.22%)。在目的水平上,共鑒定170目,大于1%的序列共20個(gè)。在科水平上,共鑒定213科,大于1%的序列共17個(gè)。在屬水平上,共鑒定225屬,大于1%的序列共5個(gè)。

而ITS1所有序列中,7615條(10%)為沒(méi)有被分類(lèi)的序列,其余的序列在門(mén)的水平上以Ascomycota所占比例最大為60%,依次分別為Basidiomycota(24%)、Chytridiomycota(5%)和Zygomycota(1%)(圖1b)。在綱的水平共鑒定98綱,大于1%的序列共11個(gè),從大到小依次為Sordariomycetes(30.81%,21.77%—45.86%)、Agaricomycetes(23.78%,9.58%—42.72%)、Eurotiomycetes(11.83%,6.02%—21.49%)、Dothideomycetes(3.99%,2.50%—5.23%)、Chytridiomycetes(3.08%,0.12%—16.42%)、IS-s-Chalara sp(2.63%,0.04%—10.30%)、Leotiomycetes(2.12%,0.84%—4.64%)、Un-s-Ascomycota sp(1.82%,0.75%—3.29%)、Pezizomycetes(1.60%,0.06%—5.13%)、Un-s-Chytridiomycota sp(1.47%,0.30%—4.21%)和Un-s-fungal endophyte(1.16%,0.13%—5.71%)。在目的水平上,共鑒定196目,大于1%的序列共19個(gè)。在科水平上,共鑒定330科,大于1%的序列共19個(gè)。在屬水平上,共鑒定435屬,大于1%的序列共22個(gè)。

圖1 16S rDNA (a)和ITS1 reads(b)總體分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 Overall taxonomic sequence analysis for all bacterial 16S reads(a) and fungal ITS1 reads(b)

圖2 不同樹(shù)葉處理下人參土壤細(xì)菌、真菌的聚類(lèi)分析圖 Fig.2 Weighted Unifrac UPGMA cluster of bacterial and fungal communities associated with different soil samples from different leaf-added treatments. The figure was constructed on the basis of Illumina sequencing data

利用聚類(lèi)分析對(duì)不同樹(shù)葉處理下人參土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性分析結(jié)果(圖2)。如圖所示人參細(xì)菌群落可以被聚成四組：第一組包括處理E和處理F,第二組包括處理A和處理C,第三組包括處理D,第四組包括處理B。真菌群落同樣可以被分成四組：第一組包括處理B和處理F,第二組包括處理C和處理D,第三組包括處理A；第四組包括處理E。主坐標(biāo)分析進(jìn)一步揭示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成與添加不同樹(shù)葉有關(guān)。

在門(mén)的水平上,所有樹(shù)葉凋落物處理人參土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群前五位相同(圖3),依次為Proteobacteria(35.38%—43.698%)、Acidobacteria(17.10%—20.34%)、Actinobacteria(12.77%—14.76%)、Gemmatimonadetes(7.85%—9.36%)、Chloroflexi(4.37%—5.02%)。但是細(xì)菌Firmicutes、Crenarchaeota、Verrucomicrobia、Nitrospirae、Bacteroidetes在不同樹(shù)葉處理土壤中地位不同。在門(mén)的水平上,人參土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群均為Ascomycota,添加樹(shù)葉處理土壤中真菌Basidimoycota豐度為第二位,而對(duì)照土壤中真菌Chytridiomycota為第二位(圖3)。

圖3 不同樹(shù)葉處理土壤細(xì)菌、真菌在門(mén)水平上系統(tǒng)分類(lèi)圖Fig.3 Taxonomic classification of bacterial and fungal reads of soil samples with different leaf addition treatments at the phylum level, using RDP classifier

為了明確不同樹(shù)葉處理對(duì)土壤微生物的地位的影響,利用SAS 9.0軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明細(xì)菌Bacteroidetes在闊葉林樹(shù)種土壤中豐度顯著高于針葉林,而Proteobacteria在添加樹(shù)葉處理中顯著高于對(duì)照土壤(P<0.05),可能與樹(shù)葉在土壤中分解轉(zhuǎn)化有關(guān)。不同樹(shù)葉處理下,真菌Ascomycota的豐度赤松樹(shù)葉處理與對(duì)照之間存在極顯著差異,而樹(shù)葉處理B土壤真菌Basidiomycota的豐度極顯著低于處理C、處理D和處理E(P<0.01)(圖4)。不同樹(shù)葉處理下土壤細(xì)菌Proteobacteria和Bacteroidetes及真菌Ascomycota和Basidiomycota多樣性不同,可能是響應(yīng)特定樹(shù)葉分解的功能微生物,如Bacteroidete和Ascomycota適宜在高微生物量氮(126.48—145.90 mg/kg)、全氮(2.66—4.11 mg/kg)及有效磷(29.33—52.80 mg/kg)土壤條件下生存,而Ascomycota適宜在低有效鉀(128.67—206.86 mg/kg)條件下生存。

圖4 不同處理下土壤主要細(xì)菌和真菌豐度差異性Fig.4 Dominant bacterial and fungal relative abundance of phylogenetic genera in different treatments圖中小寫(xiě)字母表示在0.05水平下呈顯著差異水平,**表示在0.01水平下呈極顯著差異水平

利用LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)在不同處理間不同分類(lèi)水平進(jìn)一步尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker(圖5)。色木槭樹(shù)葉凋落物土壤標(biāo)志性細(xì)菌種群為根瘤菌目(Rhizobiales),標(biāo)志性真菌種群為炭疽菌Colletotrichum_anthrisci。赤松樹(shù)葉凋落物土壤標(biāo)志性真菌包括兩個(gè)屬和兩個(gè)種,兩個(gè)屬分別為Chalara和Xenopolyscytalum,兩個(gè)種分別為Exophiala_equina和Podospora_glutinans。胡桃楸樹(shù)葉凋落物土壤標(biāo)志性細(xì)菌為紅螺菌目Rhodospirillales。紫椴標(biāo)志性細(xì)菌為鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas,標(biāo)志性真菌為Harzia_acremonioides。蒙古櫟樹(shù)葉凋落物土壤標(biāo)志性真菌共有1個(gè)科和4個(gè)屬,一個(gè)科為盤(pán)菌科Pezizaceae,4個(gè)屬分別為T(mén)richoderma、Pilidiella、Minimedusa和Talaromyces。

圖5 LEfSe分析進(jìn)化分枝圖Fig.5 Cladogram of soil bacterial and fungal in different treatments via LEfSe method identifies the significantly different abundant taxa(LDA score=4.0)進(jìn)化分支圖由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門(mén)至種的分類(lèi)級(jí)別；在不同分類(lèi)級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類(lèi),小圓圈直徑大小與相對(duì)豐度大小呈正比；著色原則為將無(wú)顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色,其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進(jìn)行著色

2.3 土壤性質(zhì)與微生物多樣性的相關(guān)性

枯枝落葉是土壤中碳氮主要來(lái)源,但是不同樹(shù)葉對(duì)土壤中理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)影響不同,特別是土壤微生物量碳氮、全氮及速效氮磷鉀(表2)。為了揭示土壤理化因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,利用CANOCO 5.0對(duì)土壤因子pH(pH值)、SOC(土壤有機(jī)碳)、TN(全氮)、C/N(碳氮比)、AN(速效氮)、AP(速效磷)、AK(速效鉀)、SMBC(微生物量碳)和SMBN(微生物量氮)與細(xì)菌(Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Firmicutes、Crenarchaeota、Chloroflexi、Verrucomicrobia、Nitrospirae和Bacteroidetes)及真菌(Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota和Zygomycota)開(kāi)展冗余分析(圖6)。結(jié)果表明SMBN、TN、AP、SOC、AK、C/N、pH值與細(xì)菌Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria及真菌Basidiomycota、Zygomycota、Chytridiomycota及Ascomycota相關(guān),受添加樹(shù)葉種類(lèi)影響。不同樹(shù)葉處理土壤包含不同的微生物群落結(jié)構(gòu)組成,功能微生物通過(guò)地位改變響應(yīng)不同樹(shù)葉處理,可能與土壤理化性質(zhì)有關(guān),特別是土壤中SMBN、TN、AP、SOC、AK、C/N、pH值有關(guān),Chu等人在中國(guó)北方森林土壤微生物中研究發(fā)現(xiàn)微生物地位改變與微生物碳氮密切相關(guān),盡管其他環(huán)境因子也可能與微生物群落結(jié)構(gòu)組成有關(guān)[30]。

分析Axis1的特征值為0.7928,解釋度為83.24%,Axis2的特征值為0.0959,解釋度為10.07%,Axis1和Axis2對(duì)整體的解釋度為93.31%,且前四個(gè)Axis解釋度達(dá)到99.04,P值為0.046。

3 討論

3.1 不同樹(shù)葉處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤pH是人參選地的一個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)[16],而土壤容重直接影響人參根的形態(tài)建成[31]。添加不同樹(shù)葉處理后土壤容重降低、pH提高(表2)。之前研究表明人參生長(zhǎng)適宜的條件為容重小于1 g/cm3、微酸性且具有高的養(yǎng)分供應(yīng)能力[32]。人參連作土壤呈現(xiàn)pH值降低、養(yǎng)分含量下降、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)紊亂[33],本研究中添加不同樹(shù)葉處理后土壤pH及容重改變可能有助于提高人參生長(zhǎng)過(guò)程抵抗環(huán)境脅迫能力。

添加不同樹(shù)葉處理后人參土壤有機(jī)碳、全氮、速效氮磷含量均增加,但是不同樹(shù)葉處理增加程度不同。在森林生態(tài)系統(tǒng)中,落葉分解是促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)的一個(gè)重要途徑,樹(shù)種和落葉量直接影響土壤養(yǎng)分含量[34-35]?？葜β淙~被視為土壤有機(jī)碳主要來(lái)源且影響著有機(jī)碳的礦化率,添加樹(shù)葉后土壤有機(jī)碳、全氮及速效氮磷含量有不同程度增加,特別是添加胡桃楸、紫椴和蒙古櫟樹(shù)葉的3個(gè)處理土壤有機(jī)碳增加幅度最大,進(jìn)一步證實(shí)落葉能夠提高土壤養(yǎng)分含量[36-37]。其機(jī)理可能是樹(shù)葉通過(guò)微生物分解在地球化學(xué)循環(huán)中產(chǎn)生巨大的碳流,將樹(shù)葉中養(yǎng)分歸還到土壤中,使其有助于植物生長(zhǎng)[38]。除此之外,微生物自身繁衍受到碳源和養(yǎng)分的限制,進(jìn)而影響樹(shù)葉分解過(guò)程。

圖6 不同處理下人參土壤微生物與土壤因子冗余分析 Fig.6 Redundancy analysis(RDA) based on the relative abundance of miacrobial phyla and select soil properties in adding leaf litter treatmen變形菌門(mén),Proteobacteria；酸桿菌門(mén),Acidobacteria；放線菌門(mén),Actinobacteria；芽單胞菌門(mén),Gemmatimonadetes；厚壁菌門(mén),Firmicutes；泉古菌門(mén),Crenarchaeota；綠彎菌門(mén),Chloroflexi；疣微菌門(mén),Verrucomicrobia；硝化螺旋菌門(mén),Nitrospirae；擬桿菌門(mén),Bacteroidetes；子囊菌門(mén),Ascomycota；擔(dān)子菌門(mén),Basidiomycota；壺菌門(mén),Chytridiomycota；接合菌門(mén),Zygomycota

添加不同樹(shù)葉后土壤中微生物量碳氮含量增加,但增加程度不同,其中色木槭對(duì)土壤微生物量碳氮增加效果最明顯,這與前人在森林土壤中研究微生物量碳氮一致[5,39]。原因可能是添加樹(shù)葉后為土壤微生物提供了更多種類(lèi)的碳源,促進(jìn)微生物的繁衍[40]。土壤C/N被視為土壤質(zhì)量變化的指示因子,其大小能夠反映養(yǎng)分利用效率、同時(shí)與碳氮循環(huán)及養(yǎng)分植物有效性有關(guān)[41],Hawke和Vallance[40]已經(jīng)證實(shí)在土壤微生物參與有機(jī)質(zhì)分解過(guò)程中低C/N促進(jìn)養(yǎng)分的釋放,本研究中添加樹(shù)葉后土壤中C/N均低于8(對(duì)照8.36),而有機(jī)碳和土壤速效氮磷含量較高。進(jìn)一步說(shuō)明C/N能夠調(diào)節(jié)土壤微生物繁衍和養(yǎng)分釋放之間的平衡。

3.2 不同樹(shù)葉處理對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響

添加不同樹(shù)葉處理人參土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,功能微生物地位發(fā)生改變。人參土壤細(xì)菌和真菌群落組成受針葉林和闊葉林分類(lèi)影響較大,闊葉林之間微生物群落結(jié)構(gòu)組成相近(圖2)。其原因可能是闊葉林樹(shù)葉分解引入土壤中碳含量比針葉林高,且闊葉林中包含更為豐富的碳源種類(lèi),導(dǎo)致了闊葉林下土壤微生物多樣性高于針葉林[42]。而針葉林微生物群落組成相對(duì)單一,且針葉林土壤中含有大量的不易被微生物利用的木質(zhì)素和腐殖酸,分解過(guò)程中主要以分解復(fù)雜結(jié)構(gòu)有機(jī)碳為主的微生物(K-strategists)主導(dǎo)[12],由于碳源的種類(lèi)及含量導(dǎo)致了不同樹(shù)種微生物集群的改變。

不同樹(shù)葉處理后人參土壤優(yōu)勢(shì)微生物種類(lèi)相同,但是功能微生物地位發(fā)生改變。選擇適宜樹(shù)種是林下參護(hù)育成敗的關(guān)鍵,盡管樹(shù)葉凋落物對(duì)土壤微生物影響的研究較多[43-44],但是林下參土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能響應(yīng)樹(shù)葉凋落物分解的研究尚屬空白。樹(shù)葉的分解是影響土壤養(yǎng)分組成和微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素,而不同的土壤特性可以誘導(dǎo)土壤微生物集群的改變[45],本研究中土壤細(xì)菌Proteobacteria是所有樹(shù)葉處理中的優(yōu)勢(shì)菌群,被視為樹(shù)葉分解轉(zhuǎn)化的主要功能細(xì)菌,該研究結(jié)果與先前研究結(jié)果相一致[46-47]。除此之外,細(xì)菌Bacteroidetes在闊葉林處理下豐度顯著高于針葉林(圖4),而細(xì)菌Bacteroidetes已被證實(shí)是闊葉林分解的關(guān)鍵細(xì)菌[48],這有助于進(jìn)一步評(píng)價(jià)闊葉林和針葉林對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響。添加樹(shù)葉后真菌Basidimoycota和Chytridiomycota地位同樣發(fā)生改變,與不同樹(shù)葉所含的有機(jī)碳結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不同,同時(shí)真菌自身繁衍對(duì)環(huán)境碳源和氮源的選擇性,導(dǎo)致真菌地位的改變,比如真菌Ascomycota多樣性高于對(duì)照, Basidiomycota多樣性在赤松樹(shù)葉處理土壤中高于胡桃楸、紫椴和蒙古櫟處理的土壤。

土壤細(xì)菌的不同分類(lèi)水平上,在紫椴樹(shù)葉凋落物處理土壤中鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas在目、科水平下特異表達(dá)，鞘氨醇單胞菌屬可能是紫椴樹(shù)葉處理的特異細(xì)菌。鞘氨醇單胞菌屬已被證實(shí)能夠分泌過(guò)氧化氫酶、提高植物抗逆性,被視為植物益生菌[49],該細(xì)菌屬可能與林下參高抗逆性有關(guān)。不同樹(shù)葉處理下土壤真菌在不同分類(lèi)水平上特異表達(dá)。炭疽菌Colletotrichum_anthrisci為色木槭凋落物特異土壤真菌[50],疽菌是引起人參炭疽病的主要致病菌,需要警惕。赤松凋落物土壤真菌包括兩個(gè)屬(Chalara和Xenopolyscytalum)和兩個(gè)種(Exophiala_equina和Podospora_glutinans),目前相關(guān)功能并不清楚,可能與針葉林分解有關(guān)。Harzia_acremonioides為紫椴樹(shù)葉凋落物特異真菌。在屬水平上,Trichoderma、Pilidiella、Minimedusa和Talaromyces為蒙古櫟土壤特異真菌,該菌屬可能參與凋落物的分解。

4 結(jié)論

土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成受不同樹(shù)葉添加物影響,盡管不同樹(shù)葉添加后對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物種群改變不大,但是功能微生物地位發(fā)生改變。添加不同樹(shù)葉后提高了土壤中微生物量碳氮含量、增加土壤速效氮磷含量,同時(shí)改變土壤pH值和容重；18個(gè)土壤樣品基因組,經(jīng)16S和ITS測(cè)序分別得到6064和1900個(gè)OUTs。其中細(xì)菌涵蓋了42門(mén)、117綱、170目、213科、225屬,真菌涵蓋了24門(mén)、98綱、196目、330科、435屬。細(xì)菌Proteobacteria是樹(shù)葉分解的關(guān)鍵微生物。而細(xì)菌Bacteroidetes和真菌Basidiomycota可能是區(qū)別闊葉林和針葉林樹(shù)種的關(guān)鍵微生物,真菌Ascomycota是針葉林分解的功能微生物。從不同分類(lèi)水平上得到特定樹(shù)葉凋落物的特異細(xì)菌和真菌,不同樹(shù)葉處理下人參土壤功能微生物的位置及多樣性的改變均與土壤因子有關(guān)。通過(guò)進(jìn)一步分析不同樹(shù)葉對(duì)土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響,將有助于模擬森林土壤微生物分布、繁衍及多樣性,對(duì)于林下參選地和農(nóng)田栽參土壤微生物改良具有實(shí)踐意義。

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