陳朝陽，姚茹，王璐，王晨陽，郭民，宋國華，張銳虎

(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原　030001)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是各種因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成以肺實質(zhì)彌漫性炎癥為特征的呼吸疾病[1]。研究報道，炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肺組織損傷是ALI發(fā)病的主要機制[2]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，也是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，能夠激活單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，促使促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的釋放，激活中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和炎癥介質(zhì)氧自由基，導(dǎo)致肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[3-4]。活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，可抑制氧自由基清除劑超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)等酶的活性，損傷肺組織造成ALI的發(fā)生[5]。因此，尋求抑制氧化和炎癥靶點的藥物對ALI防治具有重要作用。

蓮心堿(liensinine, LIE)，是從中草藥蓮子心中提取的一種雙芐基四氫異喹啉類生物堿[6]。余萬桂等[7-8]研究了蓮心堿對大鼠腦缺血再灌注的影響，發(fā)現(xiàn)蓮心堿能夠改善腦神經(jīng)功能障礙，縮小腦梗死面積，增強抗氧化物酶SOD、GSH的活性，減少炎性因子TNF-α的表達,由此可推測蓮心堿可能既具有抗氧化又具有抗炎癥的作用。因此，本研究通過建立LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，探討蓮心堿對ALI的抗炎、抗氧化保護作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物

6～8 周SPF雄性BALB/c小鼠72只，20～22 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供【SCXK(晉)2015-001】，動物實驗在該中心屏障動物實驗室中進行【SYXK(晉)2015-001】。實驗期間動物給予自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為20～24℃，相對濕度控制在40%～70%，明暗各12 h交替。本實驗操作符合實驗動物倫理學(xué)要求(倫理審批號：IACUC2017-007)。

1.1.2藥物與試劑

蓮心堿購自北京中科質(zhì)檢生物有限公司，批號：2586-96-1；LPS、Evans blue購自美國Sigma公司；瑞氏吉姆薩染色購自TNF-α、IL-6、IL-1βELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。ROS、SOD、GSH、MPO試劑盒購自南京建成有限公司。

1.1.3儀器

輪轉(zhuǎn)切片機(RM2235，Leica公司,德國)，倒置顯微鏡(BX51，Olympus公司，日本)，流式細(xì)胞儀(FACS-Calibur，BD公司，美國)，微孔分光光度計(Epoch，Biotek公司，美國)，高速微量離心機(3-18k，Sigma公司，美國)，電熱恒溫水浴鍋(HH-2，北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2　方法

1.2.1構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型

將72只小鼠隨機分為六組，正常對照組、模型組(LPS)、蓮心堿(2、4、8 mg/kg)組、地塞米松(dexamethasone，DEX，5 mg/kg)組，每組12只。小鼠禁食12 h后，分別尾靜脈注射生理鹽水、蓮心堿和地塞米松。給藥1 h后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將LPS滴注入小鼠鼻孔中(10 μg LPS，用50 μL PBS溶解)，正常組小鼠鼻孔內(nèi)滴注50 μL PBS[9]，12 h后犧牲小鼠。

1.2.2收集支氣管肺泡灌洗液和相應(yīng)指標(biāo)檢測

小鼠處死后，暴露氣管并將導(dǎo)管插入氣管，用1 mL注射器抽取0.5 mL PBS進行灌洗，灌洗3次收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)[10]。取一部分BALF采用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量，其余BALF迅速4℃、1400 r/min、10 min離心，取上清液置-20℃凍存,按照ELISA試劑盒說明書方法分別檢測炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，離心后的沉淀用于細(xì)胞分類計數(shù)，采用瑞氏吉姆薩(Wright-Giemsa)染色法進行細(xì)胞涂片。

1.2.3肺毛細(xì)血管通透性檢測

處死小鼠前15 min每組取6只，按2 mL/kg經(jīng)尾靜脈注射2%的伊文思藍(lán)后處死小鼠，處死時立即抽取左心室血液，用針頭刺入右心室，生理鹽水沖洗肺血管至沖洗液澄清為止，取肺組織放入1 mL/100 mg的甲酰胺溶液中浸泡，50℃隔水式培養(yǎng)箱溫育24 h，提取伊文思藍(lán)滲出液在分光光度計620 nm下檢測吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算伊文思藍(lán)含量[11]。

1.2.4病理組織的觀察

取右肺上葉置4%的中性甲醛中固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片4 μm，烤片，脫蠟，HE染色，脫水透明，封片。

1.2.5勻漿組織中MPO、MDA、SOD、GSH的檢測

取右肺下葉，液氮研磨后，加入PBS制成勻漿組織，漩渦振蕩并3 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑說明書分別進行MPO、MDA、SOD、GSH的檢測。

1.2.6肺組織中ROS的檢測

取左肺組織，用研磨棒邊研磨邊以PBS沖洗，收集細(xì)胞懸液于300 μm尼龍網(wǎng)過濾，PBS重懸后細(xì)胞計數(shù)不少于106細(xì)胞個/mL。每組樣品加入10 μmol/L的熒光探針 DCFH-DA，37℃孵育30 min，1400 r/min離心10 min，用PBS洗滌2次后收集細(xì)胞沉淀物，加入200 μL binding buffer用流式細(xì)胞儀進行檢測，結(jié)果以平均熒光強度值(每個細(xì)胞含有的熒光強度)表示。

1.3　統(tǒng)計分析

2　結(jié)果

2.1　各組小鼠急性肺損傷的病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，正常對照組肺組織無明顯病理學(xué)改變；LPS組可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，支氣管肺泡壁增厚和肺充血；蓮心堿組可見炎性細(xì)胞和支氣管肺泡壁厚度的減少，肺充血現(xiàn)象的減弱，隨著蓮心堿濃度的增加，抑制作用越明顯；地塞米松組基本可改善肺組織損傷至正常對照組的病理改變(見圖1)。

注：A.對照組；B.LPS組；C.蓮心堿組(2 mg/kg)；D.蓮心堿組(4 mg/kg)；E.蓮心堿組(8 mg/kg)；F.地塞米松組(5 mg/kg)。圖1　各組小鼠急性肺損傷的病理學(xué)改變(HE, ×100)Note. A. Control group. B. LPS group. C. LIE group(2 mg/kg). D. LIE group(4 mg/kg).E.LIE group(8 mg/kg). F.DEX(5 mg/kg).Fig.1　Pathological changes of acute lung injury in the mice in each group (HE staining, ×100)

2.2　各組BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的比較

ELISA檢測結(jié)果顯示，LPS組BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量明顯高于正常對照組，而蓮心堿組和地塞米松組均低于LPS組，且蓮心堿呈劑量依賴性抑制關(guān)系，差異有顯著性(P< 0.05)(見表1)。

2.3　各組細(xì)胞計數(shù)和MPO活性的比較

Wright-Giemsa染色涂片結(jié)果顯示，LPS組BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)明顯高于正常對照組，而蓮心堿組和地塞米松組均低于LPS組，且蓮心堿呈劑量依賴性抑制關(guān)系，差異有顯著性(P< 0.05)。勻漿組織中MPO活性的檢測結(jié)果，LPS組MPO的活性明顯高于正常對照組，而蓮心堿組和地塞米松組MPO的活性顯著低于LPS組，且蓮心堿呈劑量依賴性抑制關(guān)系，差異有顯著性(P< 0.05)(見表2)。

2.4　各組BALF中的蛋白濃度和肺毛細(xì)血管通透性的比較

BCA試劑盒檢測BALF中的蛋白濃度結(jié)果，LPS組的蛋白濃度明顯高于正常對照組，而蓮心堿組和地塞米松組均低于LPS組，且蓮心堿呈劑量依賴性抑制關(guān)系，差異有顯著性(P< 0.05)。Evans Blue染色結(jié)果顯示，LPS組伊文思藍(lán)含量顯著高于正常對照組，而蓮心堿組和地塞米松組的伊文思藍(lán)含量均低于LPS組，且蓮心堿呈劑量依賴性抑制關(guān)系，差異有顯著性(P< 0.05)(見表3，圖2)。

表1　各組BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的比較Tab.1　Comparison of the contents of TNF-α, IL-6, IL-1β in the BALF of each

注：與對照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group;*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

表2　各組BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)和MPO活性的比較Tab.2　Comparison of the number of neutrophils and the activity of MPO in BALF of each

注：與對照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group;*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

2.5　各組MDA含量、SOD活性、GSH含量和ROS平均熒光度值的比較

肺勻漿組織中MDA、SOD、GSH的檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，LPS組勻漿上清中的SOD活力和GSH含量明顯減少，MDA含量增多，差異有顯著性(P< 0.05)，而蓮心堿組和地塞米松組可以增加SOD活力和GSH含量，減少MDA含量，且呈劑量依賴性抑制關(guān)系，與LPS組相比，差異有顯著性(P< 0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，LPS組波峰明顯比正常對照組右移，肺組織中ROS的平均熒光度值高于正常對照組，而蓮心堿組和地塞米松組的波峰均向左移，平均熒光度值均低于LPS組，差異有顯著性(P< 0.05)(見表4，圖3)。

表3　各組BALF中的蛋白含量和肺組織中伊文思藍(lán)滲出液的比較Tab.3　Comparison of the protein contents in BALF and the Evans blue labeled albumin extravasation in the lung

注：與對照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group.*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

注：A. 對照組；B. LPS組；C. 蓮心堿組(2 mg/kg)；D. 蓮心堿組(4 mg/kg)；E. 蓮心堿組(8 mg/kg); F. 地塞米松組 (5 mg/kg)。圖2　肺組織伊文思藍(lán)染色Note. A. Control group. B. LPS group. C. LIE group (2 mg/kg). D. LIE group (4 mg/kg).E. LIE group (8 mg/kg). F. DEX group (5 mg/kg).Fig.2　Evans blue-labeled albumin extravasation in the lung tissues

組別 GroupsMDA含量(nmol/mgprot)MDA content(nmol/mgprot)SOD活性(U/mgprot)SOD activity (U/mgprot)GSH 含量(μmol/gprot)GSH content (μmol/gprot)ROS平均熒光強度值ROS mean fluorescenceintensity(MFI)對照組Control group1.05±0.01123.00±1.00503.66±0.0187.72±1.00LPS組 LPS group 3.98±0.01##71.00±1.10##177.33±2.51##234.63±20.00##蓮心堿組 LIE group (2 mg/kg)1.65±0.01**82.20±1.36**353.66±3.51**178.79±17.00**蓮心堿組 LIE group (4 mg/kg)1.49±0.01**87.30±0.60**388.00±2.64**120.11±8.50**蓮心堿組 LIE group (8 mg/kg)1.42±0.01**88.20±1.05**405.00±4.00**110.15±8.00**地塞米松組DEX group1.35±0.01**110.13±1.20**411.00±6.55**105.25±5.00**

注：與對照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05,##P< 0.01, compared with the control group.*P< 0.05，**P< 0.01, compared with the LPS group.

注：A.對照組；B.LPS組；C.蓮心堿組(2 mg/kg)；D.蓮心堿組(4 mg/kg)；E.蓮心堿組(8 mg/kg);F.地塞米松組(5 mg/kg)。圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測的各組肺組織中ROS的平均熒光強度Note. A. Control group. B. LPS group. C. LIE group (2 mg/kg). D. LIE group (4 mg/kg).E. LIE group (8 mg/kg). F. DEX group (5 mg/kg).Fig.3　The mean fluorescence intensity of ROS in the lung tissues of each group detected by flow cytometry

3　討論

研究報道，急性肺部炎癥時會出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤、炎癥細(xì)胞因子增加和蛋白質(zhì)的滲出[12]。過量的活化的中性粒細(xì)胞會產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β，同時中性粒細(xì)胞的浸潤導(dǎo)致肺微血管通透性增高，血漿蛋白質(zhì)滲入肺間質(zhì)，造成肺水腫[4]。本研究成功構(gòu)建了LPS鼻腔滴入誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠炎癥模型，HE染色結(jié)果顯示，蓮心堿和地塞米松均可改善LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞浸潤、支氣管肺泡壁增厚和肺充血等病理改變。肺組織中MPO的活性是中性粒細(xì)胞浸潤的重要指標(biāo)，中性粒細(xì)胞浸潤情況結(jié)果顯示，蓮心堿和地塞米松均可降低中性粒細(xì)胞數(shù)和MPO的活性。ELISA檢測結(jié)果顯示，蓮心堿和地塞米松均可降低BALF中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。伊文思藍(lán)可與白蛋白結(jié)合，用來測定肺微血管通透性，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)的滲出情況，本結(jié)果顯示，蓮心堿和地塞米松均可降低蛋白的滲出，降低肺微血管通透性，抑制肺水腫的形成。以上實驗數(shù)據(jù)表明，蓮心堿能有效減輕LPS誘導(dǎo)的ALI的炎癥反應(yīng)。

研究報道，氧化應(yīng)激和氧自由基的過多產(chǎn)生在ALI的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[13]。LPS可誘導(dǎo)肺組織中大量中性粒細(xì)胞的積聚，致促炎細(xì)胞因子的釋放和ROS產(chǎn)生的增多，引起氧化應(yīng)激，過量的ROS可引起細(xì)胞和亞細(xì)胞器膜的脂質(zhì)過氧化，促使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的增多，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重?fù)p害，損傷肺組織致ALI，而自由基清除劑SOD、GSH可以消除氧自由基和MDA[14]。研究報道，蓮心堿對高脂血癥大鼠可提高顯著的GSH含量和SOD活性，表明蓮心堿的抗氧化活性[15]。本實驗結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)肺組織中大量ROS的產(chǎn)生且能夠顯著降低肺組織中SOD活性和GSH含量，這與ALI患者的相應(yīng)指標(biāo)變化一致[16]；而給予蓮心堿和地塞米松，ROS的平均熒光強度值降低，SOD活性和GSH含量均升高。以上實驗數(shù)據(jù)表明，蓮心堿能有效減輕LPS誘導(dǎo)的ALI的氧化應(yīng)激損傷。

本研究證實了蓮心堿可以通過減輕肺水腫和血管滲漏，改善肺組織的病理變化和氧化應(yīng)激損傷，減少中性粒細(xì)胞的浸潤和BALF中炎性細(xì)胞因子的釋放，對急性肺損傷起保護作用，具體的抗炎抗氧化作用機制需進一步深入研究。