朱華，郭亞茜，杜曉鵬，趙文杰，李彥紅，秦川

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所) 北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京　100021)

糖尿病是血糖自平衡失調(diào)導致的慢性代謝性綜合征，主要表現(xiàn)為高血糖及一系列相關癥狀。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，2014年全球糖尿病患病人數(shù)為 4.22億[1]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會2017年發(fā)布的資料，我國現(xiàn)有糖尿病患者1.14億人，超過印度，成為世界上糖尿病患者人數(shù)最多的國家[2]。糖尿病是環(huán)境菌群、宿主遺傳與免疫應激等復雜因素相互作用的結果。腸道菌群作為一種環(huán)境因素，參與宿主體內(nèi)糖脂代謝、氨基酸轉運等多種生理生化進程，顯著地影響著宿主的健康狀態(tài)。隨著高通量測序和生物信息學分析技術的不斷進步，人們對腸道菌群與糖尿病間關系的認識也越來越深入。實驗動物作為醫(yī)學科學研究必不可少的工具，其正常及疾病模型狀態(tài)下腸道微生物的結構、組成、豐度等數(shù)據(jù)是生物學背景資料的重要組成部分。本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)方法復制糖尿病大鼠模型，采用16S rDNA高通量測序技術分析建模12周內(nèi)動物腸道菌群結構和豐度的變化，為糖尿病與腸道菌群關系研究提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

SPF級雄性SD大鼠25只，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供【SCXK-(軍)2012-0012】，4～6周齡，體重150～170 g。動物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所SPF隔離設施內(nèi)【SYXK(京)2013-0014】。動物實驗通過倫理委員會的審查，批準號：ZH16002。

1.2　方法

1.2.1模型建立

大鼠按體重隨機分為對照組(C)10只、模型組(M)15只。動物禁食12 h后，腹腔注射STZ(Sigma 公司，貨號S0130)30 mg/ kg，連續(xù)注射5 d。STZ溶于0.1 mol/L pH 4.2 檸檬酸緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。對照組動物注射等體積的檸檬酸緩沖液。最后一次注射3 d后取尾靜脈監(jiān)測血糖，空腹血糖 ≥16.5 mmol/L 視為糖尿病模型成立。

1.2.2糞便采集

模型成立后4周和12周，分別在同一時間取各組大鼠新鮮直腸糞便(≥200 mg)，迅速裝入無菌凍存管中放入-80℃冰箱。

1.2.3基因組DNA提取和PCR擴增

CTAB 法提取糞便基因組 DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA是否有降解；NanoPhotometer分光光度計檢測樣品純度；Qubit2.0 Flurometer檢測DNA樣品濃度。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，使用帶 Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR。

16S V3+4 區(qū)引物(515F 和 806R)鑒定細菌多樣性。引物序列為F： 5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’；R： 5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3。等量混樣不同濃度PCR產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用Qiagen公司膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.2.4文庫構建、測序及生物信息學分析

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，檢測合格的文庫使用HiSeq進行測序，測序策略為PE250。對測序得到的有效數(shù)據(jù)進行分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類和物種分類分析。對OTUs進行豐度、α-多樣性指數(shù)分析。

1.3　統(tǒng)計學方法

實驗結果采用SPSS19.0軟件進行差異顯著性分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　動物體重和血糖的變化

注射前對照組、模型組大鼠平均體重差異無顯著性。腹腔注射STZ后，對照組動物體重穩(wěn)定增長，模型組體重增加不明顯。4周時模型組大鼠存活12只，其體重顯著低于對照組(P< 0.05)。12周時模型組動物存活10只且體重減輕，與對照組比較差異極顯著(P<0.01)。注射前對照組與模型組動物的血糖值差異無顯著性，造模4周、12周后模型組大鼠血糖升高，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.01)(表1)。

2.2　腸道菌群高通量測序結果

2.2.1糞便樣品測序結果評估

對照組和模型組動物2個時間點20個樣本共得到2 065 796條原始下機reads。比較兩組原始下機reads數(shù)、過濾后得到的高質(zhì)量Reads數(shù)、過濾后得到的高質(zhì)量序列占Raw Reads比例、含N比例大于5%的Reads占Raw Reads比例、Clean Reads中測序質(zhì)量值大于30(錯誤率小于0.1%)的堿基占總堿基(clean reads)比例，對照組、模型組在兩個時間點差異均無顯著性(表2)。

表1　注射鏈脲菌素后動物體重和血糖的變化Tab.1　Changes of body weight and blood glucose in the rats after STZ

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表2　數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計分析表Tab.2　Analysis of the filtered reads of the

組別Groups含N比例大于5%Reads占Raw Reads比例Ratio of reads containingN > 5%(%)接頭污染Reads數(shù)占Raw Reads比例Adapter Polluted Reads ratio(%)測序錯誤率小于0.1%堿基占總堿基比例Clean Q30 Bases ratio (%)造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection對照組Control group0.000.000.000.0093.82±0.2289.75±0.33模型組DM group0.000.000.000.0094.14±0.4089.62±0.37P值----0.54320.7689

2.2.2腸道菌群多樣性分析

根據(jù)OTUs代表序列與數(shù)據(jù)庫注釋文件對比，在 97%(種)水平上進行OTUs 劃分，模型組在兩個時間點所獲得的OTUs數(shù)減少，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)。Chao1指數(shù)數(shù)值越大表示菌群豐度越高，模型組Chao1指數(shù)在兩個時間點的數(shù)值均降低，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)。Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小表示腸道菌群的多樣性越強，模型組的Shannon指數(shù)數(shù)值在兩個時間點均降低，Simpson指數(shù)數(shù)值在兩個時間點均升高，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)(表3)。

2.2.3腸道菌群在門水平上的構成

測序結果顯示：對照組reads在兩個時間點主要分屬以下8個門，由多到少依次為：厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍藻菌門(Cyanobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、TM7、放線菌門(Actinobacter)。迷蹤菌門(Elusimicrobia)、綠彎桿菌門(Chloroflexi)僅在個別動物體內(nèi)檢出。

造模4周時，模型組厚壁菌門、擬桿菌門豐度與對照組比較差異無顯著性。厚壁菌門與擬桿菌門比值呈下降趨勢，與對照組比較差異無顯著性。變形菌門、藍藻菌門、軟壁菌門、TM7、放線菌門的相對豐度降低，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)。疣微菌門僅在個別動物檢出。造模12周時，模型組厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度及比值與對照組比較差異無顯著性。變形菌門、藍藻菌門、軟壁菌門、TM7的相對豐度降低，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)。放線菌門在個別動物檢出。疣微菌門、迷蹤菌門、綠彎桿菌門未檢出(表4)。

表3　模型組和對照組動物腸道菌群多樣性比較Tab.3　Comparison of the α-diversity indexes of gut microbiota between the control and diabetes

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。(下表同)

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.(The same in the following tables)

表4　腸道菌群在門水平上的構成Tab.4　Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at phylum level in the control and diabetes

組別Groups藍藻菌門Cyanobacteria 軟壁菌門Tenericutes 疣微菌門Verrucomicrobia TM7造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection對照組Control group1.20±0.450.27±0.110.27±0.021.47±0.950.19±0.010.20±0.080.06±0.010.05±0.01模型組DM group0.40±0.050.07±0.010.16±0.021.06±0.17個別檢出-0.02±0.000.02±0.00P值0.0324*0.0013**0.0452*0.0325*0.0317*0.0413*

組別Groups放線菌門Actinobacter 迷蹤菌門Elusimicrobia 綠彎桿菌門Chloroflexi 造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection對照組Control group1.54±0.111.29±0.06個別檢出個別檢出個別檢出個別檢出模型組DM group1.02±1.29個別檢出個別檢出---P值0.0112*

2.2.4腸道菌群在門以下水平的構成

在科水平，對10個相對豐度較高的菌株進行分析，造模4周時，模型組擬桿菌科(Bacteroidaceae)相對豐度增高，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)。造模12周，模型組S24-7、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、梭桿菌科(Clostridiaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)相對豐度增高，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)。(表5，圖1)

在屬水平，對10個相對豐度較高的菌株進行分析，造模4周時，模型組乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度降低、擬桿菌屬的(Bacteroides)相對豐度增高，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。造模12周，模型組乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)相對豐度增高，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)相對豐度降低，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。(表6，圖2)

表5　腸道菌群在科水平上的構成Tab.5　Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at family level in the control and diabetes

組別GroupsS24-7毛螺菌科LachnospiraceaeTuricibacteraceae造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection對照組Control group22.03±7.4423.65±8.556.62±2.257.12±1.345.26±2.054.98±1.22模型組DM group18.96±6.0227.06±9.545.91±2.476.37±2.115.02±1.234.13±1.34P值0.16650.0242*0.57800.44530.34380.5527

組別Groups梭菌科Clostridiaceae腸桿菌科EnterobacteriaceaeParaprevotellaceae造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection對照組Control group2.30±1.151.75±0.233.07±0.512.78±0.951.42±0.061.59±0.12模型組DM group2.01±0.923.32±1.012.98±1.292.25±1.011.39±0.441.21±0.34P值0.41400.0134*0.63380.54380.23120.3514

表6　腸道菌群在屬水平上的構成Tab.6　Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at genus level in the control and diabetes

組別Groups瘤胃球菌屬RuminococcusBlautia顫螺菌屬 Oscillospira造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection對照組Control group2.17±0.321.28±0.4416.62±2.2519.78±1.7315.26±1.0518.98±4.21模型組DM group1.98±0.443.09±0.9214.71±2.4715.94±1.8713.96±2.0017.01±3.98P值0.37390.0163*0.26080.35790.11580.3046

組別GroupsSMB53羅氏菌屬 Roseburia克雷伯菌屬Klebsiella造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection造模4 周4 weeks after injection造模12周12 weeks afterinjection對照組Control group10.30±3.1511.51±3.238.07±1.5110.45±2.961.42±0.261.57±0.32模型組DM group9.41±2.2210.54±2.357.52±1.299.43±1.011.21±0.141.66±0.43P值0.28600.42030.37390.54320.50970.4498

注：A 造模后4周；B.造模后12周；圖中C為對照組，M為模型組。圖1　對照組和模型組動物腸道菌群在科水平的相對豐度Note. A.4 weeks after injection; B.12 weeks after injection; C. Control group, D. Diabetes group.Fig.1　Relative abundance of bacteria in the gut microbiota at phylum level in the control and diabetes groups

注：A.造模后4周；B.造模后12周；圖中C為對照組，M為模型組。圖2　對照組和模型組動物腸道菌群在屬水平的相對豐度Note. A. 4 weeks after injection; B.12 weeks after injection; C. Control group; D. Diabetes group.Fig.2　Relative abundance of bacteria in the gut microbiota at genus level in the control and diabetes groups

3　討論

大小鼠是目前國內(nèi)外常用于腸道菌群與疾病相關性研究的實驗動物。嚙齒類有個體小，易于操作，生物背景資料清晰、價格便宜等優(yōu)點。SPF級動物飼養(yǎng)在標準環(huán)境下，可排除飲食結構、飼養(yǎng)環(huán)境、年齡差別等因素對腸道菌群的影響。但嚙齒類在解剖、生理和代謝等方面與人之間存在較大的差異，腸道菌群組成及豐度也不盡相同。充分了解實驗動物及相關模型腸道菌群的基礎數(shù)據(jù)，認識其與人菌群的差異和相似性，是利用動物模型進行腸道菌群與疾病相關性研究的前提。

從測序結果可以看出，STZ誘導糖尿病SD大鼠模型的腸道菌群結構及豐度均發(fā)生改變。

α-多樣性分析中，對照組與模型組在Chao1、Shannon、Simpson這3個指數(shù)上差異均有顯著性(P< 0.05)，Chao1、Shannon指數(shù)升高，Simpson指數(shù)降低。提示STZ誘導的糖尿病SD大鼠模型腸道菌群多樣性降低。相對豐度分析中，在門水平，對照組腸排在前5位的依次是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、藍藻菌門、軟壁菌門。其中厚壁菌門、擬桿菌門二者的總和占到了全部腸道菌的95%以上。模型組中厚壁菌門、擬桿菌門的比例略有下降，但與對照組比較無顯著性差異。相對豐度較低的變形菌門、藍藻菌門、軟壁菌門、放線菌門在模型組均有降低，與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)。但變形菌門、藍藻菌門、軟壁菌門在對照組隨動物年齡增長也出現(xiàn)相對豐度的降低，其豐度改變是與年齡相關還是與疾病相關需進一步研究。在屬水平，模型組和對照組的乳桿菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬相對豐度差異有顯著性(P< 0.05)。

據(jù)文獻報道，中國人糖尿病及前期狀態(tài)患者的腸道菌群中優(yōu)勢菌群為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭形桿菌門、放線菌門，在門水平的優(yōu)勢菌群與SD大鼠類似，但相對豐度有差異[3-4]。在屬水平，正常人群與糖尿病患者的差異菌屬主要是擬桿菌屬、普雷沃菌屬、Ⅳ型梭菌屬、乳桿菌屬、韋榮球菌屬、Blautia球菌-直腸真桿菌屬、雙歧桿菌屬，差異菌的種類與豐度與SD大鼠差別較大。在SD大鼠和人的腸道菌群中，厚壁菌門和擬桿菌門都是優(yōu)勢菌群，但在相對豐度及構成比上存在差異。有文獻報道厚壁菌門與擬桿菌門的比例不平衡與糖尿病、肥胖等相關，但研究結果不統(tǒng)一。有研究認為肥胖人群厚壁菌門占優(yōu)勢，厚壁菌門/擬桿菌門比值較高[5]；也有研究認為糖尿病患者擬桿菌門占優(yōu)勢，而厚壁菌門/擬桿菌門比值較低[6]。提示作為優(yōu)勢菌群的厚壁菌門與擬桿菌門，除相對豐度外，也應重視其比值的變化。我們的研究中厚壁菌門/擬桿菌門比值模型組與對照組比較有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義，推測可能與樣本數(shù)量較少相關。

值得關注的是放線菌門和疣微菌門，放線菌門在對照組10周齡SD大鼠(造模4周)相對豐度較高(1.54±0.11)，18周齡(造模12周)時略有下降(1.29±0.06)。而在模型組，造模4周時相對豐度為(1.02±1.29)，造模12周時僅個別檢出，放線菌門的相對豐度顯著降低。放線菌門是革蘭陽性厭氧菌，在腸道內(nèi)的相對豐度不占優(yōu)勢，但其門內(nèi)的雙歧桿菌屬是對人體健康產(chǎn)生重要作用的益生菌，在人體腸道內(nèi)較為常見[7]。雙歧桿菌可以刺激免疫應答、產(chǎn)生維生素和氨基酸、使腸道內(nèi)環(huán)境酸化，抑制腐敗菌和致病菌生長、保護腸粘膜屏障，減少內(nèi)毒素進入血液，并具有抗炎癥反應，減少結腸癌發(fā)生的作用[8,9]。在屬水平的相對分析中造模12周時雙歧桿菌的相對豐度降低(P< 0.05)，與門水平的結果相對應，提示糖尿病的發(fā)病過程可能與起益生作用的菌群減少，毒性代謝產(chǎn)物堆積有關。疣微菌門在對照組均檢出且兩個年齡段的豐度相似，而模型組動物在造模4周時僅在個別動物檢出，造模12周時未檢出，提示疣微菌門可能與STZ誘導的糖尿病病程相關。

本研究基于腸道細菌的16SrDNA高通量測序技術，對STZ誘導的SD糖尿病大鼠模型腸道菌群的結構和豐度進行了初步分析，并討論了模型動物與人有關菌群的差異和相似性，為腸道疾病與微生態(tài)方面的醫(yī)學研究提供了基礎資料。