薛曉強，趙月，王帥，趙琳，胥亞夫，王友權(quán)，王睿瑞，任同軍，韓雨哲*

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室， 遼寧 大連 116023；2.遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司， 遼寧 大連 116113)

血鸚鵡屬鱸形目(Perciformes)慈鯛科(Cichlidae)，是雌性紫紅火口(Cichlasomasynspilum♀)和雄性紅魔鬼(Cichlasomacitrinellum♂)雜交產(chǎn)生的后代，俗稱“發(fā)財魚”“財神魚”，體色紅艷，體型短圓，嘴呈心形且無法合攏[1]。因其體色艷麗，外觀漂亮，在中國大陸及臺灣地區(qū)都廣受喜愛。國內(nèi)對血鸚鵡研究較少，主要研究其體色和免疫能力[2]。幼魚在魚類的生活史中處于快速生長期[3]，是營養(yǎng)學(xué)相關(guān)實驗的良好實驗對象，具有代謝快、生長迅速等優(yōu)勢[4]。

脂肪是魚類重要的營養(yǎng)素，不僅能為機體提供能量還能補充必須脂肪酸[5]，促進其生長發(fā)育[6]。鑒于脂肪的重要性，制作魚類飼料時通常均需添加脂肪。然而脂肪的添加并不是越多越好，過量的添加，易使魚體內(nèi)脂肪累積，導(dǎo)致脂肪肝[7]，并引起魚體免疫力下降[8]。免疫酶和抗氧化酶是衡量機體健康與否的重要指標[9]。適宜的飼料脂肪水平會提升大西洋鮭(Salmosalar)的免疫酶活力[10]；也會升高花鱸(Lateolabraxmaculatus)抗氧化酶活力，但過高的脂肪水平則會使其下降[11]。盡管免疫酶和抗氧化酶在其他魚種有單獨的研究，但在血鸚鵡幼魚中對兩種酶同時評估的研究卻缺乏。因此，本研究將免疫酶和抗氧化酶構(gòu)建聯(lián)系,通過同時測定不同飼料脂肪水平飼養(yǎng)后的血鸚鵡幼魚肝臟免疫相關(guān)酶活力：堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LMZ)以及抗氧化相關(guān)酶活力：超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化酶(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)含量，研究其影響，旨在確定血鸚鵡幼魚飼料的最適脂肪添加水平。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及管理

從遼陽觀賞魚養(yǎng)殖基地購買200尾初始體重為(1.20±0.30) g的血鸚鵡，在水溫25～27 ℃，水中溶氧>7 mg/L的實驗室環(huán)境下適應(yīng)性馴養(yǎng)7 d，而后挑選健康的幼魚，進行飼喂實驗。將實驗用魚按投喂飼料的脂肪水平不同分為5組，每組30尾。本實驗使用60 cm×70 cm×120 cm的40 L超白玻璃缸，以曝氣24 h以上的自來水作為實驗水體，采用直徑1.4 cm氣石進行24 h充氣，用加熱棒維持水溫在25 ℃以上。每日8:00、12:30和16:00進行3次表觀飽食投喂，每日進行3次吸底1次換水，換水量約為1/3，實驗共飼養(yǎng)42 d。

1.2 幼魚飼料的配制及保存

實驗飼料以魚粉、豆粕、小麥粉和明膠為主要蛋白源，以豆油為主要脂肪源(配方見表1)，配制不同脂肪水平飼料CL1(粗脂肪4.77%)、CL2(粗脂肪8.75%)、CL3(粗脂肪11.68%)、CL4(粗脂肪16.25%)、CL5(粗脂肪23.70%)。飼料原料經(jīng)混合后，放入2 mm粒徑的制粒機中擠壓成顆粒，然后放入50 ℃烘箱中，至水分含量到10%，存入做好標記的自封袋中，放于-20 ℃冰箱中保存。

表1 血鸚鵡飼料配方Tab.1 Feed formula for blood parrot juveniles

注：1除明確給出的單位，其他單位均為g·kg-1，2混合維生素和混合礦物質(zhì)參照Wang等[12]。

1.3 樣品收集

采樣前，將飼養(yǎng)的血鸚鵡幼魚禁食24 h。將血鸚鵡放入冰水中，待其完全麻醉取出。每個實驗水槽隨機取5～6尾實驗魚在冰上進行無菌解剖，取肝臟，同組混樣裝入試管。將取出的樣品暫時放入液氮中快速冷凍，待全部取完，放入-80 ℃冰箱保存。

1.4 肝臟免疫及抗氧化相關(guān)酶活力測定

將之前解剖保存在-80 ℃的冰箱中的肝臟取出，按質(zhì)量體積比1∶9(g∶mL)加入4 ℃生理鹽水，使用玻璃勻漿器進行制漿，在冰水浴條件下制成10%的勻漿液，4 ℃ 2 500 r/min離心(CT15RE 型日立冷凍離心機)10 min，取上清液。實驗采用試劑盒是購自南京建成生物工程有限公司，根據(jù)試劑盒說明書對堿性磷酸酶(A059-1)、酸性磷酸酶(A060-1)、溶菌酶(A050-1)、超氧化物歧化酶(A001-3)、總抗氧化酶(A015-1)、過氧化氫酶(A007-1-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(A005)和丙二醛(A003-1)進行測定。

1.5 二次曲線回歸方程構(gòu)建

使用Excel 2007對飼料脂肪水平(%)和酶活力或濃度(U/g或nmol/mg)構(gòu)建二次曲線回歸方程，得到最適飼料脂肪水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗測得數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0(IBM, USA)進行統(tǒng)計分析，使用Turkey’s方法進行多重比較，且P<0.05，認為差異性顯著。結(jié)果采用平均值±標準差(Mean±SD)方式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料脂肪水平對血鸚鵡幼魚肝臟免疫酶活力的影響

由表2可知，血鸚鵡肝臟酸性磷酸酶(ACP)活力隨飼料脂肪水平升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在CL4組粗脂肪含量16.25%的時候達到最大值，與CL3組無顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于CL1、CL2和CL5組(P<0.05)；堿性磷酸酶(AKP)活力與ACP趨勢相同，即先上升后下降，在CL4組粗脂肪含量16.25%時達到最高并顯著高于其他各組(P<0.05)；溶菌酶(LZM)活力也呈先上升后下降的趨勢，在CL3組粗脂肪含量11.68%時達到最大，與其他組差異顯著(P<0.05)。

2.2 飼料脂肪水平對血鸚鵡幼魚肝臟抗氧化酶的影響

由表3可知，超氧化物歧化酶(SOD)活力隨飼料脂肪水平升高呈先升高后降低的趨勢，在CL3組粗脂肪含量11.68%時活力最高，與CL4組無顯著性差異(P>0.05)，但與CL1、CL2和CL5組差異顯著(P<0.05)；總抗氧化酶(T-AOC)活力表現(xiàn)為先上升后下降，在CL3組脂肪含量11.68%時最大且顯著高于其他各組(P<0.05)；過氧化氫酶(CAT)活力趨勢為先升高后下降，在CL4組粗脂肪含量16.25%時最高，顯著高于其他組(P<0.05)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力呈先上升后下降趨勢，在CL3組粗脂肪含量11.68%時達到最大且顯著高于其他各組(P<0.05)；丙二醛(MDA)呈先上升后下降的趨勢，在CL4組粗脂肪含量16.25%時達到最大，與CL3組差異不顯著(P>0.05)，但與其余3組有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 二次曲線回歸方程分析

通過多重比較分析得知，免疫酶中AKP隨著飼料脂肪水平的變化最為明顯；抗氧化酶中GSH-Px和CAT則易受飼料脂肪水平影響，其中前者又比后者更敏感。因此，本研究以AKP、GSH-Px和MDA為重要關(guān)注指標構(gòu)建二次曲線回歸方程，從而確定血鸚鵡幼魚飼料中最適宜的脂肪水平。AKP二次曲線回歸方程為y1=-4.820 1x12+161.44x1-602.61，R2=0.729 0；GSH-Px二次曲線方程為y2=-14.687x22+460.88x2-166 3，R2=0.615 5；MDA二次曲線回歸方程為y3=-0.033 3x32+1.052 4x3-4.119 6，R2=0.685。當(dāng)x1=15.54時，y1達到最大值；當(dāng)x2=15.69時，y2達到最大值；當(dāng)x3=15.80時，y3達到最大值。因此，血鸚鵡幼魚飼料脂肪建議濃度為15.80%～16.75%時有利于提高免疫酶和抗氧化物酶含量。

表2 飼料脂肪水平對血鸚鵡肝臟免疫酶活力的影響Tab.2 Effects of dietary lipid levels on the immune enzyme activity of blood parrot juveniles

注：同一列用不同字母表示差異性顯著P<0.05，下同。ACP(acid phosphatase)為酸性磷酸酶, AKP(alkaline phosphatase)為堿性磷酸酶,LMZ(lysozyme)為溶菌酶。

表3 脂肪飼料水平對血鸚鵡抗氧化酶活性的影響Tab.3 Effect of dietary lipid levels on the antioxidative enzymes of blood parrot juveniles

注:CAT(catalase)為過氧化氫酶, GSH-Px(glutathione peroxidase)為谷胱甘肽過氧化氫酶, MDA(malondialdehyde)為丙二醛。

3 討論

3.1 飼料脂肪水平對血鸚鵡幼魚免疫酶的影響

ACP是吞噬溶酶體的重要組成部分，ACP在細胞吞噬和包囊反應(yīng)中被釋放，參與對帶磷酸酯基團異物的降解過程[13]。AKP能夠促進營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和吸收，從而加強機體的非特異性免疫能力[14]。本研究中ACP和AKP是保持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)所必需的酶，當(dāng)免疫水平升高或降低時，它們會產(chǎn)生相應(yīng)的變化[15-16]。本研究中ACP和AKP活力先上升后下降，與付旭等[17]對淡黑鑷麗魚(Labidochromiscaeruleus)的研究結(jié)果相符，且低脂肪水平組CL1和CL2組顯著低于較高脂肪水平CL3和CL4組(P<0.05)，但高脂肪水平的CL5組也顯著低于CL3和CL4組(P<0.05)。肝臟的免疫能力是與飼料中適宜的脂肪含量并非呈現(xiàn)簡單的正相關(guān)性，而是Λ型，即脂肪在適宜濃度時可提高其免疫力，高于此濃度則降低。LMZ是魚體內(nèi)重要的非特異免疫酶，在機體免疫過程中能催化水解細菌細胞壁而導(dǎo)致細菌溶解死亡[18-19]，LMZ活力也可間接的反映機體免疫狀態(tài)。本研究中LMZ活力先上升后下降，與陳乃松等[20]對大口黑鱸(Micropterussalmoides)的研究結(jié)果一致，低脂肪水平組CL1和CL2組顯著低于較高脂肪水平CL3和CL4組(P<0.05)，但高脂肪水平的CL5組顯著低于前面4組(P<0.05)，這說明添加適量脂肪水平，可促進血鸚鵡幼魚肝臟免疫能力，但過高則不益。3種免疫酶活力在過高的飼料脂肪水平都出現(xiàn)了下降的趨勢，其原因可能是由于脂肪過量引起代謝應(yīng)激并提高了肝臟代謝率，降低機體免疫力[21]。

3.2 飼料脂肪水平對血鸚鵡幼魚肝臟抗氧化相關(guān)酶的影響

SOD作為抗氧化酶，能夠清除有危害性的活性氧，通過催化歧化作用將過氧化物自由基轉(zhuǎn)變成過氧化氫和氧[22-23]。CAT能夠?qū)Ⅲw內(nèi)的過氧化氫分解成水和氧氣，提高機體抗氧化能力。本研究中SOD和CAT活力均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，這與施兆鴻等[24]對褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratu)的研究趨勢一致。本研究中，當(dāng)飼料脂肪水平為11.68%和16.25%時，SOD活力未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，而CAT活力則出現(xiàn)了顯著性差異(P<0.05)；但Mourente等[25]對金頭鯛(SparusaurataLinnaeus)的研究以及崔培等[26]對紅白錦鯉(Cyprinuscarpiohaematopterus)的實驗結(jié)果均為SOD和CAT出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，此與本實驗結(jié)果不一致，這可能是由于酶對外界刺激所產(chǎn)生的變化具有周期性，不同條件下機體對刺激產(chǎn)生適應(yīng)所需時間也不同[27]。T-AOC活力與SOD和CAT活力趨勢相同也是隨著飼料脂肪水平的升高，先上升后下降，與張晨捷等[28]對云紋石斑魚(Epinehelusmoara)的研究結(jié)果相符，較高脂肪組CL3顯著高于低脂肪組CL1和CL2組，并顯著高于較高脂肪組CL4，高脂肪組CL5(P<0.05)，這可能是飼料中過量的脂肪，減弱了機體消除自由基的能力，增加了體內(nèi)過氧化物含量而抑制了機體抗氧化能力[29]。GSH-Px是機體中重要的過氧化物分解酶，它能把有害的過氧化物還原成無害的羥基化合物，起到保護細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的作用[30]。在本研究中，GSH-Px活力隨飼料脂肪水平升高，出現(xiàn)了先升高后降低的現(xiàn)象，與孫陽等[31]對紅鰭東方鲀的研究結(jié)果一致，其中較高脂肪組CL4顯著高于較低脂肪組CL1和CL2、較高脂肪水平組CL3和高脂肪水平組CL5(P<0.05)，說明適量提高飼料脂肪水平可提高血鸚鵡抗氧化能力，但過高的脂肪會使血鸚鵡抗氧化能力降低。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，是反映氧化應(yīng)激的重要指標，其含量的升高是脂質(zhì)過氧化物增多的表現(xiàn)[32]，可直接用來判斷肝臟受損程度。本研究中MDA隨飼料脂肪水平的上升，呈先升高后降低趨勢，但張春暖等[33]對梭魚的研究和施兆鴻等[24]對褐菖鲉的研究結(jié)果均為MDA隨飼料脂肪水平升高而升高，這與本實驗結(jié)果不一致，其原因可能是其他抗氧化酶活力的下降，作為代謝產(chǎn)物的MDA減少。本研究中，隨飼料脂肪水平的升高，血鸚鵡幼魚肝臟免疫及抗氧化酶的活力均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，兩者受飼料脂肪水平的影響趨勢相似，反映了血鸚鵡幼魚肝臟免疫酶和抗氧化酶的密切關(guān)系。

血鸚鵡為人工雜交的品種，其母本紫火山口為雜食性魚類，父本紅魔鬼為肉食性魚類，但血鸚鵡作為人工培育品種，其食性尚未有明確定義。王吉橋等[34]對七彩神仙魚(Symphysodonaequifasciata)的研究表明，七彩神仙魚幼魚飼料中適宜脂肪含量在12.02%～17.17%之間；在李雪菲等[35]的實驗中，美國紅魚(Sciaenopsocellatus)飼料的最適脂肪水平為7.19%～9.17%；蝦類和其他甲殼類動物在飼料脂肪水平5%～6%時增重效果最為明顯[36]。本研究通過二次曲線回歸方程尋找到血鸚鵡幼魚飼料脂肪水平為15.80%～16.75%，高于多數(shù)雜食性魚類對飼料脂肪的需求量，與肉食性淡水熱帶魚七彩神仙魚相似，本研究的結(jié)果能夠為血鸚鵡幼魚飼料的營養(yǎng)精準配制提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究對體重為(1.20±0.30)g的血鸚鵡幼魚飼喂5組不同脂肪水平飼料42 d，通過測其肝臟免疫相關(guān)酶及抗氧化酶活力，發(fā)現(xiàn)血鸚鵡幼魚肝臟免疫及抗氧化酶活力隨飼料脂肪水平升高呈先上升后下降的趨勢，通過建立二次曲線回歸方程得出：血鸚鵡幼魚最適飼料脂肪為15.80%～16.75%。本研究能夠為血鸚鵡幼魚實用飼料營養(yǎng)的精準供給提供理論基礎(chǔ)。

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