武世雄，姜欣彤，王偉*，張賽賽，2，董安然，王宏宇，李瑩

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室； 2.大連市水產(chǎn)技術(shù)推廣點總站：遼寧 大連 116023)

大瀧六線魚[1-2](Hexagrammosotakii)屬鲉形目(Scorpaeniformes)、六線魚科(Hexagrammidae)、六線魚屬(Hexagrammos)，俗稱黃魚。大瀧六線因其味道鮮美且營養(yǎng)價值較高[3]，而深受消費者喜愛，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖上具有重要的經(jīng)濟價值。其廣泛分布于中國東部(主要為遼寧省和山東省)沿海及日本、韓國、朝鮮等國的近海。然而，近年來海洋資源匱乏問題日益突顯，大瀧六線魚資源捕撈量逐漸加大而捕撈個體體型逐漸減小[4]。因此，開展大瀧六線魚的種質(zhì)資源研究，選育新的優(yōu)良品種，已變得非常迫切。

遺傳多樣性是種質(zhì)資源的重要組成部分，豐富的遺傳多樣性是漁業(yè)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，以及培育優(yōu)良性狀新品種的前提條件，才能夠為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟效益。目前，關(guān)于遺傳多樣性分析的常用方法主要有形態(tài)學(xué)標記、細胞學(xué)標記、生化標記和分子標記等。其中，微衛(wèi)星分子遺傳標記具有多態(tài)性高、共顯性等特點，并且片段小、易操作[5]，能更好地體現(xiàn)物種的遺傳多樣性[6]。通過統(tǒng)計與分析微衛(wèi)星位點的有效等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量等結(jié)果，可以較好地反映群體內(nèi)遺傳變異情況。微衛(wèi)星分子標記已被廣泛地應(yīng)用于鯉[6-9]、大黃魚[10-11]、黃顙魚[12-13]、石斑魚[14-15]等多種魚類[16-22]。劉奇[23]利用跨種擴增方法，篩選了7對適合大瀧六線魚群體分析的微衛(wèi)星引物(其中有3對引物來自十線六線魚)，研究了中日沿岸的11個地理群體的遺傳變異，但該研究中7個取樣群體集中在遼寧沿海以外區(qū)域，其中只選取了大連黃海地區(qū)的兩個取樣點，對于近年廣泛分布于遼寧黃渤海沿岸的大瀧六線魚遺傳多樣性的評價還不夠全面。本研究應(yīng)用7對適合大瀧六線魚群體分析的微衛(wèi)星引物(有3對引物來自十線六線魚)，對遼寧沿海和青島近海大瀧六線魚野生群體進行基因組掃描，評價大瀧六線魚天然種質(zhì)特征和遺傳多樣性特點，以期進一步豐富大瀧六線魚遺傳學(xué)信息，為加強大瀧六線魚天然資源保護和人工繁育增殖工作提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究使用大瀧六線魚分別采自大連(市區(qū)、長?？h、瓦房店和旅順)、丹東(東港)和青島6個地區(qū)。為保證實驗魚樣品具有真實的代表性，各群體樣品均為漁港碼頭野生采捕獲得，樣品規(guī)格為(20.00±1.50)cm。采捕后，樣品低溫運輸?shù)綄嶒炇液罄鋬霰４?，備用核酸提取。采樣點分布見圖1，樣品信息采集見表1。

圖1 大瀧六線魚各群體的采樣地點Fig.1 Sampling sites of 6 populations of Hexagrammos otakii

表1 大瀧六線魚群體的采樣地、測序數(shù)量及地理坐標Tab.1 Locality, numbers and geographicalcoordinates of Hexagrammos otakii

群體Populations采樣地Sampling site樣本數(shù)量/尾Sample amount經(jīng)度Longitude緯度LatitudeDG東港 30E 124°05'21″N 39°48'02″CHX長海縣30E 122°35'46″N 39°15'20″DL大連 30E 121°32'59″N 38°51'47″WFD瓦房店30E 121°27'44″N 39°40'27″LS旅順 30E 121°06'22″N 38°48'25″QD青島 30E 120°18'50″N 36°03'29″

1.2 基因組DNA的提取

將冷凍保存的樣品剪取魚尾部的肌肉組織0.10 g，將魚肉組織放入無菌的1.5 mL離心管中，加400 μL勻漿液和20 μL SDS，用小剪刀充分剪碎肌肉組織至勻漿狀態(tài)，然后再加3 μL蛋白酶K，充分混勻，于55 ℃水浴鍋消化至澄清。

向離心管中加入100 μL乙酸鉀溶液抽提，緩慢搖動離心管，4 ℃靜置30 min后離心(4 ℃，12 000 r/min)10 min；將上清液吸出(400 μL)放于另一離心管中，加入預(yù)冷的無水乙醇1 000 μL使DNA沉淀，輕微振蕩離心管，待有絮狀沉淀產(chǎn)生后，在-20 ℃靜置2 h,離心(4 ℃，12 000 r/min)10 min后，將離心后的無水乙醇小心倒掉，并且用70%乙醇進行2次清洗，將清洗后的離心管中加入無水乙醇(200 μL)再次離心，將沉淀物取出至另一離心管中，敞口放置于室溫下干燥，待殘留的乙醇完全揮發(fā)干凈后，再加入50 μL TE，置于4 ℃冰箱1～2 h，使DNA充分溶解。

1.3 微衛(wèi)星引物

1.3.1 微衛(wèi)星序列的查找

采用SSRHunter1.3軟件對Gene Bank上大瀧六線魚的64條序列進行查找，找出含有微衛(wèi)星的序列。SSRHunter1.3軟件的參數(shù)設(shè)置為查找含有二堿基、三堿基、四堿基、五堿基或六堿基分別重復(fù)5次以上片斷的序列。

1.3.2 微衛(wèi)星引物的設(shè)計

挑選含有微衛(wèi)星的序列通過Primer premier 5.0軟件設(shè)計出32對引物，將得分前10的引物序列送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

設(shè)計引物[24]的主要參數(shù)如下：引物長度為18～24 bp，其中22 bp最為適宜；PCR產(chǎn)物的分子量大小為125～325 bp；最適的退火溫度為50～60 ℃；GC的含量為40%～70%，最適為50%。

1.3.3 微衛(wèi)星引物的篩選

設(shè)計好的引物經(jīng)優(yōu)化PCR條件獲得3對擴增穩(wěn)定的引物，編號為LY；另外4對編號為Heot的微衛(wèi)星引物引自Chen等[25]的研究結(jié)果。序列信息見表2。

1.4 PCR擴增

反應(yīng)體系中含基因組DNA 1 μL(約10 mg/L)，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21 mmol/L，dNTP混合物0.2 mmol/L，3′和5′端引物各0.4 mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序按照[26]：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火45 s，72 ℃延伸45 s，反應(yīng)進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

表2 基因組掃描分析所用微衛(wèi)星標記及其引物Tab.2 Microsatelite markers and primers used in genomic scanning

注: F示上游引物,R示下游引物。

1.5 數(shù)據(jù)分析

電泳凝膠經(jīng)美國UVP凝膠成像系統(tǒng)(BioSpectrum?AC Imaging System，USA)成像，結(jié)合凝膠電泳分析軟件Gel-Pro Analyzer 4.0，根據(jù)標準Marker(DL100)讀出擴增片段長度的大小，確定個體的基因型。利用Popgene 1.32軟件處理數(shù)據(jù)，進行卡方檢驗估計各個基因座在每個群體中是否偏離Hardy-Weinberg平衡，計算各個群體各個座位的等位基因頻率(allele frequency)、等位基因數(shù)(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、遺傳相似系數(shù)(genetic similarity index,I)、群體間遺傳距離[27](genetic distance,Ds)等。用PIC_Calc 0.6軟件計算多態(tài)信息含量 (polymorphism information content,PIC)[28]。用MEGA 4.1軟件以UPGMA算法制作分子進化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

微衛(wèi)星的7個標記在群體中經(jīng)過PCR擴增后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果表現(xiàn)出較為清晰的片段大小以及穩(wěn)定的多態(tài)性，其中部分標記見聚丙烯酰胺凝膠電泳圖2。

圖2 7個位點在長?？h群體的擴增電泳圖Fig.2 Electrophoresis patterns of CHX population at 7 locus

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

微衛(wèi)星DNA遵循不受外界壓力的中性選擇原則，因此在一個理想群體中，各等位基因在群體中的分布頻率基本不會改變。運用Hardy-Weinberg精確P值的無偏估測對各群體的多基因座進行的多群體檢測(multi-populations test),其原理是基于馬可夫鏈模型(Markov chain method)。本研究檢測結(jié)果顯示，6個大瀧六線魚群體的Hardy-Weinberg平衡偏離常數(shù)均發(fā)生了極顯著的偏離，其結(jié)果說明6個大瀧六線魚群體具有極顯著的遺傳不平衡。單群體單基因座檢測(HW test for each locus in each population)結(jié)果顯示，6個群體中表現(xiàn)為極顯著的遺傳不平衡(P<0.01)的基因座占全部基因座比例的64.00%，表現(xiàn)為顯著的遺傳不平衡(0.010.05) 的基因座占全部基因座的31.00%(表3)。

表3 大瀧六線魚群體遺傳平衡分析Tab.3 Genotypic equilibrium analysis on 6 Hexagrammos otakii populations

注:*表示顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0. 05)，**表示極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。

2.3 遺傳多樣性

本研究中大瀧六線魚的6個群體是CHX、DG、DL、QD、LS、WFD，各位點有效等位基因數(shù)(Ne)的檢測結(jié)果為1.00～5.72個，各群體中有效等位基因數(shù)(Ne)平均值依次為4.16、2.84、3.09、2.43、3.08和2.43；各位點觀測雜合度(Ho)在0.00～0.74之間，各群體平均值為0.26、0.17、0.21、0.05、0.09和0.05；各位點期望雜合度(He)在0.00～0.84之間，各群體平均值為：0.75、0.61、0.69、0.44、0.69和0.44；各位點多態(tài)信息含量(PIC)在0.00～0.80之間，各群體平均值為0.69、0.52、0.52、0.47、0.52和0.47(表4)。在所檢測的7個位點中，Heot17的多態(tài)性最低(0.47)，其次為Heot42(0.61)，其余5個位點在6個群體中均呈現(xiàn)較高的多態(tài)性。各群體中，青島群體QD和瓦房店群體WFD的遺傳多樣性最低(0.47)，長?？h群體CHX最高(0.69)。6個大瀧六線魚群體間的幾種統(tǒng)計參數(shù)均存在一定差異，但方差分析并未達到顯著水平(P>0.05)。

表4 大瀧六線魚群體的多樣性指數(shù)Tab.4 The genetic diversity indices for 6 Hexagrammos otakii populations

續(xù)表4，Tab.4 Contiuned

注：“0.000 0”表示保留4位小數(shù)后無進位，“—”表示未檢出數(shù)值。

2.4 遺傳分化

6個大瀧六線魚群體的基因分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)信息見表5。由基因分化系數(shù)可知其中LY6和Heot06在群體間成中度遺傳分化(0.050.25)。由基因流的大小可知，LY6、Heot03和Heot06位點在群體間分化程度中等(1

2.5 聚類分析

基于等位基因頻率，計算出大瀧六線魚6個地理群體間的遺傳相似度(I)和遺傳距離(Ds)，結(jié)果如表6所示：WFD與QD群體間的遺傳相似度最高(0.660 9)，DL與QD群體間最低(0.372 6)；WFD與QD群體間的遺傳距離最近(0.414 1)，DL與QD群體間最遠(0.987 2)?；贜ei’s標準遺傳距離的UPGMA聚類圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)6個群體分為2類，DL和CHX兩群體親緣關(guān)系較近單獨聚為一個分支，QD和WFD群體先聚為一類，再與LS群體聚為一類，最后與DG群體聚在一起形成另一大分支。

表5 大瀧六線魚群體各位點的基因分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)Tab.5 Coefficient of gene differentiation(Fst)and gene flow (Nm)among 6 Hexagrammos otakii populations

表6 大瀧六線魚群體之間的遺傳相似性指數(shù)I(對角線上方)和遺傳距離Ds(對角線下方)Tab.6 Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance (below diagonal) for 6 populations of Hexagrammos otakii

注：“—”示無數(shù)據(jù)。

圖3 基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的6個大瀧六線魚 群體UPGMA樹Fig.3 The dendrogram of 6 Hexagrammos otakii populations based on standard genetic distance using UPGMA method

3 討論

3.1 群體的遺傳多樣性

生物群體的遺傳多樣性是評價物種資源狀況的一個重要依據(jù)，它是物種適應(yīng)多變的環(huán)境條件，維持長期生存和進化的基礎(chǔ)。最大限度地維持種內(nèi)遺傳多樣性水平，是持續(xù)利用種質(zhì)資源的前提[29]。雜合度(heterozygosity,H)和多態(tài)信息含量(PIC)等都是反映群體遺傳多樣性的度量，其值直接反映群體內(nèi)個體的均勻度。遺傳變異是通過雜合度反映在各個群體的多個位點上表現(xiàn)出來的，雜合度是度量群體遺傳變異的一個最適參數(shù)[30]。如果觀測雜合度值(Ho)和期望雜合度值(He)越接近，則表明該種群受自然選擇以及種內(nèi)近交等因素的影響越小，因而群體處于一個遺傳平衡狀態(tài)[30]。本研究中，6個大瀧六線魚群體CHX、DG、DL、QD、LS和WFD的平均觀測雜合度分別為：0.26、0.17、0.21、0.05、0.09和0.05，均遠小于它們對應(yīng)的平均期望雜合度(0.75、0.61、0.69、0.44、0.69和0.44)，表明這6個群體均處于遺傳不平衡狀態(tài)，這個不平衡狀態(tài)與Chen等[25]的研究結(jié)果一致。分析原因可能是這幾個群體間基因交流由于地理環(huán)境等因素變少，在多代繁殖過程中主要形式為種內(nèi)間的近交繁殖，因此造成了部分等位基因的丟失，從而出現(xiàn)雜合子缺失的現(xiàn)象。而根據(jù)表4發(fā)現(xiàn)，6個群體的有效等位基因數(shù)Ne分別為4.16、2.84、3.09、2.43、3.08和2.43，也與其等位基因數(shù)Na(分別為5.43、4.33、3.83、3.50、4.33和3.50)相差較大。分析有效等位基因數(shù)目的減少可能是由于生存環(huán)境的逐漸惡化、人們的肆意捕撈和活動導(dǎo)致的水體污染加劇，魚類的產(chǎn)卵場所遭到破壞等[14]，這些原因都可導(dǎo)致有效種群縮小，致使有效等位基因丟失。

在評價一個基因座位在種群中的多樣性的一個重要標準為多態(tài)信息含量(PIC)，其值越高，說明基因豐富度越高，表明該群體的遺傳多態(tài)性水平越高。Botstein等[28]提出檢測結(jié)果PIC≥0.50時，說明該基因座為高度多態(tài)基因座；當(dāng)PIC≤0.25時，則為低度多態(tài)基因座；當(dāng)結(jié)果PIC處于兩者之間時，稱為中度多態(tài)基因座。本研究結(jié)果中，除Heot17基因座的多態(tài)性較低(0.47)，其余位點的PIC值均大于0.50，表現(xiàn)為高多態(tài)，說明其等位基因分布較均勻，多態(tài)性較高，適合用于大瀧六線魚的遺傳多樣性研究。6個群體中，青島和瓦房店群體的PIC值低于0.50，均為0.47；其他4個群體為0.52～0.69，由小到大依次為東港(0.515 4)、大連(0.515 9)、旅順(0.519 7)和長?？h(0.689 1)，各群體都表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。以上數(shù)據(jù)說明，盡管6個大瀧六線魚群體有效等位基因數(shù)的結(jié)果顯示數(shù)量較少，但其他多態(tài)性指標的結(jié)果顯示仍保持著偏高的水平，因此6個大瀧六線群體具有較高的遺傳多樣性特征。

3.2 群體的遺傳分化

種群的遺傳結(jié)構(gòu)受地理隔離、生存環(huán)境、種群瓶頸、基因流、選擇等多種因素的影響,其中任一因素的變化都可能會造成該種群的遺傳結(jié)構(gòu)改變。遺傳變異是為了適應(yīng)不斷變化的生存環(huán)境必須經(jīng)歷的過程[29]。表示群體間分化的遺傳分化系數(shù)(Fst)的值范圍是0～1。當(dāng)群體的所有等位基因頻率幾乎相同時，F(xiàn)st的值接近于0，各群體間幾乎沒有分化；當(dāng)群體間的遺傳分化增大時，說明遺傳多樣性幾乎存在于各群體之間，F(xiàn)st的值接近于1。6個大瀧六線魚群體的微衛(wèi)星座位遺傳分化系數(shù)(Fst)的平均值為0.27，表明26.79%的遺傳分化來自群體內(nèi)，73.21%的遺傳分化來自群體間，各群體之間存在高度的遺傳分化。Nm與Fst呈負相關(guān)[Nm=0.25(1-Fst)/Fst]，因此遺傳流所反映的群體遺傳分化與基因分化系數(shù)是類似的。Slatkin等[31]認為，理論上，當(dāng)Nm﹤1時，遺傳漂變是影響群體間遺傳分化的主要因素；當(dāng)Nm>1時，基因流是影響種群遺傳分化的主要因素。根據(jù)公式計算得出群體間基因流的均值(0.68)，可以認為大瀧六線魚的種群間的分化結(jié)果是遺傳漂變造成的。

遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離是衡量群體親緣關(guān)系的重要指標，一級親緣關(guān)系的個體間遺傳相似指數(shù)為0.5，二級親緣關(guān)系為0.25。6個大瀧六線魚群體之間遺傳相似系數(shù)(I)為0.37～0.66，幾乎接近種內(nèi)不同群體間的遺傳相似度水平，同一物種不同群體間的遺傳相似應(yīng)該比較高，此次研究的這6個大瀧六線魚群體間的遺傳相似性水平也比較符合這一點?；诖鬄{六線魚群體之間遺傳距離(Ds)構(gòu)建的UPMGA系統(tǒng)樹顯示，6個群體在系統(tǒng)發(fā)生中可以分為2個大類，這樣的聚類結(jié)果與它們在地理上的分布距離沒有顯著的相關(guān)性。結(jié)合大瀧六線魚群體間基因流(Nm)的均值為0.68<1，說明大瀧六線魚群體間的分化很可能是遺傳漂變造成的。也就是說，造成群體間遺傳分化大于群體內(nèi)遺傳分化的主要原因不是基因交流，而很可能是遺傳漂變，因此與地理距離無關(guān)。

結(jié)合形態(tài)學(xué)[32]、線粒體序列的聚類分析[33]結(jié)果來看，每種方法獲得的系統(tǒng)樹不盡相同，其中一個最可能的原因在于系統(tǒng)樹的構(gòu)建過程中會受到所選擇的分子標記引物、物種、分析軟件以及計算方法等因子的影響，但因子的選擇目前又沒有一個統(tǒng)一的標準，所以導(dǎo)致最后分析的結(jié)果有所差異，這種現(xiàn)象在鮭科魚類的研究中也有所體現(xiàn)[34]。但是，本研究結(jié)合微衛(wèi)星標記與形態(tài)學(xué)[32]、線粒體序列的聚類分析[33]的研究結(jié)果顯示，大瀧六線魚群體間發(fā)生了較大的遺傳分化，遺傳多樣性較為豐富。本研究對驗證6個大瀧六線魚存在遺傳多樣性分化有積極意義。

已發(fā)現(xiàn)大瀧六線魚自然資源銳減，這提示我們要吸取長江鰣瀕臨滅絕后再采取措施的教訓(xùn)，現(xiàn)階段應(yīng)即刻開始著手大瀧六線魚繁育技術(shù)研究，實現(xiàn)科學(xué)的人工增殖，積極保護大瀧六線魚資源。保護魚類首先要保護種質(zhì)資源，豐富的遺傳信息是增殖和育種的基礎(chǔ)。大瀧六線魚分布于西北太平洋、日本和朝鮮半島近海、中國黃海等地，期望全球?qū)＜衣?lián)合起來，共同摸清掌握大瀧六線魚各地理群體遺傳多樣性信息。

4 結(jié)論

本研究利用7對微衛(wèi)星分子標記對大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)的6個地區(qū)群體(大連、丹東和青島等地)進行了遺傳多樣性和遺傳分化評估。結(jié)果表明：1)LY2、LY5 、LY6、Heot03、Heot06和Heot42 6個微衛(wèi)星標記位點的PIC值均大于0.50，表現(xiàn)為高多態(tài)性，說明本方法適合用于大瀧六線魚的遺傳多樣性研究；2)6個大瀧六線魚群體的微衛(wèi)星座位遺傳分化系數(shù)(Fst)的平均值為0.27<0.50，表明大瀧六線魚遺傳分化主要來自群體間；3)大瀧六線魚群體間基因流(Nm)平均值為0.68<1，推測大瀧六線魚群體間的遺傳分化較大可能是遺傳漂變造成的。

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