李廣，李世順，李敏，呂德亮，丁君，常亞青，左然濤

(大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院， 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

海膽屬于棘皮動物門(Echinodermata)，游走亞門(Eleutherozea)，海膽綱(Echinoidea)，現(xiàn)存800多種。海膽自然分布范圍廣，在中國、日本、法國、美國、加拿大和澳大利亞等地區(qū)均有養(yǎng)殖[1]。海膽?zhàn)B殖的餌料以海帶、裙帶菜和石莼等大型藻類為主，這些傳統(tǒng)餌料存在著營養(yǎng)不均衡、供應(yīng)不穩(wěn)定和容易腐爛變質(zhì)等諸多缺點[2]。因此，開發(fā)海膽人工配合飼料勢在必行。已有研究結(jié)果表明，北方球海膽(Strongylocentrotusdroebachiensis)[3-5]、加州紅海膽(Strongylocentrotusfranciscanus)[6]、綠海膽(Lytechinusvariegatus)和中間球海膽(Strongylocentrotusintermedius)[7-8]能夠很好地吸收利用人工配合飼料，且能夠顯著促進海膽的生長和性腺發(fā)育速率。中間球海膽(S.intermedius)原產(chǎn)于日本北海道和俄羅斯遠東沿海，由于其性腺色澤好，味甜，富含蛋白質(zhì)、長鏈多不飽和脂肪酸和必需氨基酸，在國際市場上廣受歡迎。1989年，大連海洋大學將其引入中國，對其進行馴化及培育，現(xiàn)已成為中國北方重要的海水養(yǎng)殖品種[9]。

海膽中長鏈多不飽和脂肪酸以花生四烯酸(ARA, 20:4n-6)和二十碳五烯酸(EPA, 20:5n-3)為主，且ARA作為長鏈多不飽和脂肪酸的重要成員，已被證實在海膽性腺發(fā)育過程中可以顯著累積在卵細胞中[10]。近年來，腸道菌群組成對動物生長的影響越來越受到關(guān)注。研究表明，油酸在離體狀態(tài)下可以刺激反芻動物瘤胃中纖維素降解相關(guān)菌群反芻動物月形單胞菌(Selenomonasruminantium)和牛肝菌(Butyrivibrioruminicola)的生長[11]；南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)中的腸道菌群會受到飼料脂肪源的影響[12]；膳食中添加魚油較葵花油更易改變9月齡之前新生兒腸道菌群組成[13]。因此，脂肪酸飽和度與腸道菌群組成密切相關(guān)[14-15]。在斑馬魚(Daniorerio)中，腸道菌群能夠調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和脂肪酸代謝，從而影響脂滴的形成[15]。不僅如此，腸道菌群在營養(yǎng)物質(zhì)消化、脂肪代謝和免疫反應(yīng)過程中也發(fā)揮著重要作用[10]。有關(guān)中間球海膽營養(yǎng)生理方面的研究已有較多報道[16-21]，但關(guān)于脂肪酸調(diào)控海膽腸道菌群變化的研究卻罕見。因此，本研究探討了飼料中ARA對中間球海膽存活、生長率和腸道菌群組成的影響規(guī)律，以期為明確ARA添加對中間球海膽存活、生長和腸道菌群組成的影響和開發(fā)適合中間球海膽的微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實驗飼料配制

實驗飼料以海藻粉、豆粕和魚粉為主要蛋白源，小麥粉為主要糖源，通過梯度添加ARA粉(甘油三酯型，100 mg/g，武漢嘉必優(yōu)生物科技有限公司)和豆油配置等氮(24%)、等脂(4.5%)的4種飼料，使得飼料干物質(zhì)中ARA水平依次為0.0、0.5%、1.0%和2.0%。具體配方和營養(yǎng)成分見表1和表2。

首先將所有飼料原料過80目篩網(wǎng)，所有干粉物質(zhì)的飼料先混合均勻，然后把豆油均勻搓至混合飼料，最后加入水形成面團，水的添加量為飼料原料總質(zhì)量的25%。利用自動制粒機制作成顆粒飼料，40 ℃下恒溫烘干12 h，冷卻，密封袋包裝，儲存于-20 ℃冰箱中備用。

表1 飼料配方和營養(yǎng)成分分析(%， 以干重計)Tab.1 Formulation and proximate composition of the experimental diets(%，eq.-dry diet) %

注：1表示海藻粉是以海帶粉、海帶藻粉與馬尾藻科按質(zhì)量比1∶1配制而成的混合物。以干物質(zhì)計，其粗蛋白的含量為18.0%，粗脂質(zhì)為0.9%，購自營口現(xiàn)代漁業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園(中國遼寧省營口市)。2表示以干物質(zhì)計，豆粕的粗蛋白含量為43.4%，粗脂質(zhì)的含量為1.9%，購自營口現(xiàn)代漁業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園(中國遼寧省營口市)。3表示以干物質(zhì)計，魚粉的粗蛋白含量為68.1%，粗脂質(zhì)的含量為10.2%，購自青島七好生物科技有限公司(中國山東省青島市)。4表示以干物質(zhì)計，小麥粉的粗蛋白含量為16.4%，粗脂質(zhì)的含量為1.0%，購自營口現(xiàn)代漁業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園(中國遼寧省營口市)。5表示復合礦物質(zhì)(mg·kg-1或g·kg-1飲食)：CuSO4·5H2O，10 mg; Na2SeO3(1%)，25 mg；ZnSO4·H2O，50 mg；CoCl2·6H2O(1%)，50 mg；MnSO4·H2O，60 mg; FeSO4·H2O，80 mg； Ca(IO3)2，180 mg; MgSO4·7H2O，1 200 mg；沸石，18.35 g。6復合維生素(mg·kg-1或g·kg-1飲食)：維生素D，5 mg；維生素K，10 mg；維生素B12，10 mg；維生素B6，20 mg；葉酸，20 mg；維生素B1, 25 mg；維生素A，32 mg；維生素B2,45 mg；泛酸，60 mg；生物素，60 mg；煙酸，200 mg；α-生育酚，240 mg；肌醇，800 mg；抗壞血酸，2 000 mg；微晶纖維素，16.47 g。7ARA粉劑中ARA的純度為100 mg·g-1，以甘油三酯的形式存在，購自嘉必優(yōu)生物技術(shù)有限公司(中國湖北省武漢市)。

表2 飼料脂肪酸組成(g·kg-1, 以濕重計)Tab.2 Fatty acid content of formulated feeds (g·kg-1, eq.-wet weight) in this study

注：某些含量較少、微量或未檢出的脂肪酸，如C22:0、C20:0、C24:0、C14:1、C20:1n-9、C22:1n-11、C20:2n-6、C20:3n-6和C22:5n-3未在表中列出。1SFA(saturated fatty acids)為飽和脂肪酸。2MUFA(monounsaturated fatty acid)為單不飽和脂肪酸。3PUFA(polyunsaturated fatty acid)為多不飽和脂肪酸。

1.2 攝食生長實驗

攝食生長實驗在農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室進行。實驗海膽來自于大連旅順養(yǎng)殖場，均屬于同一日齡，初始重量約為60 g。在攝食生長實驗之前，將所有中間球海膽(S.intermedius)成膽暫養(yǎng)在1 m3的水槽中，每2天換水一次，換水量為水槽總體積的1/2，并且吸除槽底殘餌和糞便，然后投喂海膽體重5%～10%的配合飼料，使其適應(yīng)餌料和養(yǎng)殖環(huán)境。2周之后，測定海膽初始體重(W0)后隨機分配至12個網(wǎng)籠(20 cm×30 cm×50 cm)中，每個網(wǎng)籠20只海膽。每種飼料投喂3個平行網(wǎng)籠的海膽，攝食生長實驗持續(xù)56 d。每天記錄海膽的存活狀況，以海膽的附著力消失或者掉刺現(xiàn)象作為海膽死亡的標準。實驗期間，水溫為(14±5)℃，鹽度為30，水中溶氧大于7.0 mg/L。

1.3 取樣

在56 d投喂實驗結(jié)束后，記錄海膽存活情況及海膽的終末體重(Wt), 每個網(wǎng)籠隨機取10只海膽，無菌解剖取其腸道內(nèi)容物并收集于滅菌離心管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中待測。

1.4 腸道菌群多樣性分析

1.4.1 DNA提取和PCR擴增

利用E.Z.N.A.?DNA試劑盒(美國Omega Bio-tek)對腸道總菌群DNA進行提取，并利用NanoDrop (美國Thermo Fisher Scientific)對DNA進行定量。

PCR擴增細菌16S rDNA的V3～V4 區(qū)，引物序列為：515F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。擴增條件如下：95 ℃ 3 min預變性； 95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s， 進行27個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.4.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用Gene JET(美國Thermo Scientific)膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (美國Axygen Biosciences)對PCR產(chǎn)物進行純化。

1.4.3 文庫構(gòu)建和上機測序

使用NEB Next?4 UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina(美國New England Biolabs)建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，再使用Illumina MiSeq上機測序。

采用Mothur中的Pre. Cluster軟件對測序進行校正；采用UCHIME(美國)軟件，以SILVA數(shù)據(jù)庫中序列作為模板去除嵌合體；采用UCLUST軟件對序列進行聚類，并對操作分類單元進行覆蓋率和稀缺型曲線分析，以及豐富度指數(shù)(Chao)和多樣性指數(shù)(Simpson)分析。

1.5 數(shù)據(jù)計算與分析

成活率(grow rate,GR, %)=實驗結(jié)束時海膽存活數(shù)量/實驗開始海膽存活數(shù)量×100

式(1)

增重率(weight gain rate,WGR, %)=(終末體重Wt- 初始體重W0)/初始體重W0×100

式(2)

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，在單因素方差分析達到顯著水平時(P<0.05)，采用Turkey’s檢驗進行多重比較，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤。

2 結(jié)果

2.1 飼料中ARA添加量對海膽存活率和生長影響

由表3可見，飼料中ARA添加量未對海膽成活率產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。隨著飼料中ARA添加量的增加，海膽終末體重和增重率均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當飼料中ARA添加量為1.0%時，海膽終末體重最高，雖然與2.0% ARA添加組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于未添加ARA組和0.5% ARA處理組(P<0.05)。飼料中ARA添加量對海膽增重率的影響也呈先升后降趨勢，即ARA添加濃度為1.0%時，海膽增重率最高(12.70%)，而未添加組最低(3.11%)(表3)。

表3 飼料中ARA含量(%，以干重計)對中間球海膽成活率和增重率的影響Tab.3 Effects of dietary ARA(%，eq.-dry weight) on growth performance of adult sea urchin (Strongylocentrotus intermedius)

注：同一列內(nèi)不同上標字母表示平均值有顯著性差異(P<0.05)，標相同字母或者沒有標注字母的表示平均值顯著性差異不顯著(P>0.05)。

2.2 飼料中ARA含量對海膽腸道菌群多樣性的影響

本次測序深度為5×104條tags，測序有效覆蓋率約為99%。Shannon指數(shù)反應(yīng)菌群組成多樣性，該指數(shù)越大多樣性越高。本研究中海膽腸道菌群Shannon指數(shù)平均值為2.68～3.06，當飼料中ARA含量為1.0%時，海膽腸道菌群多樣性最高，但是不同飼料組海膽間差異不顯著(表4)，且與Simpson多樣性指數(shù)分析的結(jié)果相一致。

2.3 飼料中ARA對海膽腸道菌群組成的影響

本研究中，海膽腸道菌群豐度較高的6個門分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋桿菌門(Spirochaetae)、軟壁菌門(Tenericutes)和梭桿菌門(Fusobacteria)(圖5)。其中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)菌群的豐度隨著飼料中ARA含量增加出現(xiàn)了升高的趨勢；厚壁菌門(Firmicutes)和軟壁菌門(Tenericutes)的豐度隨著飼料中ARA含量增加出現(xiàn)了下降的趨勢；螺旋桿菌門(Spirochaetae)和梭桿菌門(Fusobacteria)的豐度隨著飼料中ARA含量增加出現(xiàn)了無規(guī)律的變化，但飼料中ARA對所有菌群豐度均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)(表5)。本研究中海膽腸道菌群Chao1指數(shù)分布在174.1～196.7，當飼料中ARA含量為0.5%時，海膽腸道菌群多樣性最高，但是不同飼料組海膽間差異不顯著(P>0.05，表4)。因此，推斷總菌群的豐度不受飼料中ARA含量的影響。

表4 飼料中ARA含量(%，以干重計)對海膽腸道菌群豐富度和細菌多樣性的影響Tab.4 Illumina high-throughput data, bacterial diversity richness estimator (Chao 1) and diversity estimators (Shannon and Simpson)for intestinal bacterial diversity of adult sea urchin (Strongylocentrotus intermedius) fed dietswith graded content of ARA (%，eq.-dry diet)

注：同一行內(nèi)不同上標字母表示平均值有顯著性差異(P<0.05)，標相同字母或無標注字母的表示平均值差異不顯著(P<0.05)，下同。

表5 飼料中ARA含量(%，以干重計)對海膽腸道菌群基于門水平的相對豐度的影響Tab.5 Frequency distribution of bacterial phyla in the intestine of sea urchin fed diets with graded levelof ARA(%， eq.-dry diet) %

在屬水平上，弧菌屬(Vibrio)、(Lutibacter)和芽孢桿菌屬(Bacillus)受飼料中ARA含量的影響顯著。其中，弧菌屬(Vibrio)豐度隨著飼料中ARA含量的升高而顯著升高，且在2.0% ARA處理組具有最大相對豐度(36.34%)，其次是1.0% ARA處理組(12.44%)；1.0%和2.0%ARA處理組海膽腸道中弧菌屬(Vibrio)的豐度顯著高于對照組(7.55%)(P<0.05)。隨著飼料中ARA含量的升高，海膽腸道中(Lutibacter)的相對豐度具有與弧菌屬(Vibrio)相似的變化趨勢，當飼料中ARA含量為2.0%時，該屬的相對豐度最高(31.13%)，顯著高于其他3個處理組(6.90%～11.63%)(P<0.05)。當飼料中ARA含量由0.0升高至0.5%時，海膽腸道中芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對豐度由26.00%升高至33.25%(P>0.05)，之后隨著飼料ARA含量的進一步升高顯著降低至2.08%(P<0.05，表6)。

表6 飼料中ARA含量(%，以干重計)對海膽腸道各屬細菌豐度的影響Tab.6 The relative abundance of main genus in the intestine of sea urchin in response to graded level of ARA(%，eq.-dry diet) %

注：“—”表示該屬的豐度較低，未達到檢測的限度。

3 討論

飼料中添加不同濃度的ARA雖然對海膽的成活率、腸道菌群的多樣性和門水平的相對豐度沒有顯著影響，但對海膽的增重率和海膽腸道菌群的組成有影響。此結(jié)果將為開發(fā)適合海膽的微生態(tài)制劑提供參考依據(jù)。

當飼料中ARA含量較高時(1.0%～2.0%)，海膽生長速率顯著高于ARA低添加量組和空白處理組(P<0.05)。性腺作為海膽唯一可食性部分，提高性腺質(zhì)量分數(shù)具有重要的實際意義。前期研究結(jié)果表明，當飼料中ARA含量為1.0%～2.0%時，海膽性腺指數(shù)最高(待發(fā)表)。以上實驗結(jié)果說明飼料中適宜的ARA含量對海膽的生長和生理功能具有重要的作用，這和某些海水魚相似[22-23]。但飼料中ARA的含量對海膽的成活率沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，大規(guī)格(207.16±0.72) g鱸(Lateolabraxjaponicas)成活率也不受ARA添加影響[24]，推測其原因可能是成體海洋生物體有較強的抗應(yīng)激能力，對ARA的依賴性小，所以ARA的含量對成體的成活率沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，這和某些海水魚的研究結(jié)果也類似[22-24]。因此，在海膽飼料中添加適宜含量的ARA能夠顯著提高海膽的經(jīng)濟價值。飼料中ARA含量影響水產(chǎn)動物的飼料轉(zhuǎn)化率。如在魚類的研究結(jié)果表明，當飼料中缺乏ARA時，飼料轉(zhuǎn)化率在草魚和鱸中顯著降低，即飼料利用率較差[25]。類似地，當飼料中其他必需脂肪酸如n-3 LC-PUFA(0.1%，以飼料干物質(zhì)計)含量較低時，飼料轉(zhuǎn)化率和蛋白質(zhì)沉積率也較差[26]。但本研究并未研究海膽對飼料的轉(zhuǎn)化率，這有待進一步探討。

本研究中，中間球海膽腸道中檢測到的菌群主要門類分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和軟壁菌門(Tenericutes)等。已有研究表明：變形菌門(Proteobacteria)在斑節(jié)對蝦(PenaeusMonodon)[27]、南美白對蝦[11]、斑馬魚[28]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[29]和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[30]的腸道中均具有較高的豐度。擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是人類和小鼠腸道中最為豐富的細菌門類[31]。由于擬桿菌門(Bacteroidetes)主要在纖維素分解過程中發(fā)揮重要作用，而大部分水產(chǎn)動物對糖類利用能力較差，其飼料中纖維素等碳水化合物含量相對較低，這可能是導致魚類和對蝦腸道菌群中擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度明顯低于哺乳動物的重要原因[28,32]。在海參中的研究結(jié)果也證實這一點，司濱等[33]研究表明海參腸道中擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度低于變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。隨著飼料中ARA含量的升高，厚壁菌門(Firmicutes)的豐度顯著性降低。相關(guān)研究表明，厚壁菌門(Firmicutes)的主要作用是促進腸道吸收食物中的能量，其產(chǎn)生的化合物與脂肪的沉積有關(guān)，是一類和肥胖相關(guān)的細菌[33]。厚壁菌門(Firmicutes)豐度的降低會減少脂肪酸在腸道內(nèi)沉積的概率，從而保證更多的脂肪酸能夠運輸?shù)叫韵僦?，保證性腺的正常發(fā)育，從而提高海膽的經(jīng)濟值。

在本研究中，海膽腸道中的弧菌屬(Vibrio)、(Lutibacter)和芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度較高；隨著飼料中ARA含量的升高，弧菌屬(Vibrio)的相對豐度顯著升高。盡管很多病原菌(如哈維氏弧菌)也屬于弧菌屬(Vibrio)，但是該屬中仍然有一些具有抑菌和促生長的種類，如溶藻弧菌等[34-35]。本研究中，當飼料中ARA含量為2.0%時，海膽腸道中(Lutibacter)的豐度顯著提高，其中該屬中(Lutibacterflavussp.)又參與類胡蘿卜素合成[36]。類胡蘿卜素具有較強的抗氧化功能，可以保護主要卵黃蛋白(major yolk protein，MYP)過氧化，進而增加其在性腺中的累積量[37]。芽孢桿菌屬(Bacillus)的豐度隨著飼料中ARA含量的升高而升高，芽孢桿菌屬(Bacillus)中有些種類(如Bacillussubtilis和Bacillusamyloliquefaciens)在草魚中被證實具有抗氧化的功能[38]。因此，ARA的添加有可能對海膽性腺卵黃蛋白累積和抗氧化能力提升有益，此問題也將在未來的研究中予以明確。

4 結(jié)論

添加3種不同水平的ARA對中間球海膽的成活率、腸道菌群的多樣性和門水平的相對豐度沒有顯著影響，但對海膽的增重率和海膽腸道菌群的組成有影響。當飼料中ARA的含量為1.0%時，海膽腸道內(nèi)有菌群結(jié)構(gòu)較為合理，并且海膽增重率最大，因此，1.0%為本實驗條件下ARA飼料中添加的推薦濃度。在飼料中ARA顯著影響了海膽的腸道菌群組成，且較高水平的ARA可以提高變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidete)以及弧菌屬(Vibrio)和(Lutibacter)的豐度，降低厚壁菌門(Firmicutes)和軟壁菌門(Tenericutes)以及芽孢桿菌屬(Bacillus)和(CandidatusHepatoplasma)屬的豐度；變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidete)以及弧菌屬(Vibrio)和(Lutibacter)的提高可能與促生長有關(guān)。未來研究需要在種的水平上確定對ARA敏感的細菌種類。本研究將為海膽飼料中益生菌的添加提供理論依據(jù)。

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