李紅兵 譚子虎

1.湖北中醫(yī)藥大學 武漢 430061 2.貴陽市第一人民醫(yī)院 3.湖北省中醫(yī)院

目前我國血管性癡呆（vascular dementia，VD）發(fā)病率僅次于阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），VD患者約占癡呆患者總數(shù)的20%[1]。近年來，中醫(yī)藥治療VD取得了較好效果。基于《金匱要略》薯蕷丸原方化裁而來的加減薯蕷丸（Modified Dioscorea Pills，MDP）具有補腎填精、益氣通絡、健脾調(diào)肝之功，臨床上對于非癡呆型血管性認知功能障礙及中風后失語等疾病療效顯著[2-3]。眾所周知，突觸是神經(jīng)信息傳遞與處理過程的中心環(huán)節(jié)，因此突觸的數(shù)量及功能狀態(tài)對認知功能具有決定性作用。筆者所在團隊的前期研究證實，MDP可明顯促進VD大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的mRNA表達[4]，而BDNF可促進突觸再生，提高突觸可塑性，從而改善VD大鼠智能[5]。為進一步明確MDP對VD大鼠海馬區(qū)突觸的影響，本研究從突觸相關蛋白的表達和突觸的超微結構的角度進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，8～9周齡，體質(zhì)量約（300±20）g，購自湖北省預防醫(yī)學科學院實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018]。大鼠喂養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學動物房，進食及飲水自由，飼料由湖北省預防醫(yī)學科學院提供。光照/黑暗時間 12/12h，溫度（22±2）℃，濕度（60±10）%。

1.2 主要試劑和儀器 MDP由山藥、熟地黃、何首烏、全當歸、杜仲、川芎、西黨參、茯苓、白術、白芍、枸杞、菖蒲、遠志、五味子共14味中藥組成，均由湖北省中醫(yī)院制劑室提供，經(jīng)提純濃縮制備成含藥材1g·mL-1的濃縮湯劑。小鼠抗大鼠微管相關蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2）抗體（anti-MAP-2）、小鼠抗大鼠突觸素（synaptophysin，SYP）抗體（anti-SYP）及小鼠抗大鼠突觸后密度蛋白-95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）抗體（anti-PSD-95）均購于武漢三鷹生物技術有限公司（批號分別為：17490-1-AP、17785-1-AP、20665-1-AP)。水迷宮實驗設備及軟件購于成都泰盟科技公司。Hitachi H-7000FA型透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組及造模方法 適應性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表將大鼠分為手術組28只及假手術組12只。手術組采用改良雙血管阻斷（2-vessels occlusion，2-VO）法建立大鼠VD模型，具體方法為：大鼠采用異氟烷吸入麻醉后先分離右側(cè)頸總動脈并兩端結扎，從結扎中心剪斷頸總動脈，分層縫合并以青霉素40萬U/只局部注射預防感染，1周后以同樣方法處理左側(cè)頸總動脈。假手術組大鼠不結扎及剪斷頸總動脈，其余操作步驟同手術組。VD模型造模成功判定：大鼠清醒后反應遲鈍，行動遲緩，行走不穩(wěn)，呈現(xiàn)無目的的旋轉(zhuǎn)運動。2-VO術后1周后進行1次Morris水迷宮定位航行訓練，以假手術組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，逃避潛伏期超過參考值20%的大鼠定義為癡呆大鼠。

1.4 干預措施 術后假手術組大鼠死亡1只，手術組死亡5只，存活大鼠均造模成功。將手術組存活大鼠按隨機數(shù)字表分為藥物組12只，模型組11只。2-VO術后1周，藥物組以MDP濃縮湯劑灌胃，按黃繼漢等[6]的方法，藥物劑量換算系數(shù)為0.162，藥物組大鼠灌胃1mL/100g，1次/d，即相當于成人劑量1.62g/kg·d，共灌胃45d；模型組及假手術組大鼠采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，劑量、療程及方法同藥物組。

1.5 水迷宮實驗檢測大鼠行為學改變 常規(guī)進行定位航行及空間搜索實驗[7]，共進行5d，前4d為定位航行實驗，最后1d為空間搜索實驗。定位航行實驗每天進行2次，從四個不同象限中將大鼠面向池壁放入水中，計算機自動計算每個大鼠的航行距離及逃避潛伏期。如果大鼠在120s內(nèi)找不到水下的平臺，則引導其到平臺并停留2min，使其記憶平臺與周圍環(huán)境的關系，逃避潛伏期記為120s。其余則按照實際時間和距離由計算機測算。最后1d則撤除平臺，計算大鼠在120s搜索過程中，跨越平臺次數(shù)、平臺所在象限（第一象限）游行時間、游行距離以及總游行距離。

1.6 免疫組化檢測突觸相關蛋白的表達 各組選擇8只大鼠，10%水合氯醛（0.35g·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于解剖板上，剖開腹腔，暴露肝臟和橫膈膜，迅速剪開橫膈膜，打開胸腔，暴露心臟。將灌注針頭從心尖部位經(jīng)左心室插入升主動脈，剪開右心耳，快速灌入0.9%氯化鈉溶液100～150mL，直至體循環(huán)血液沖洗干凈，灌流液轉(zhuǎn)為清亮。待大鼠尾巴伸直，四肢顫抖停止，觀察肝臟逐漸變成白色，再用4%多聚甲醛250mL灌注。40min后斷頭取腦組織，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12～24h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制備海馬石蠟切片，經(jīng)過抗原修復、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后分別添加一抗（anti-MAP-2、anti-SYP及anti-PSD-95），再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB顯色及Harris蘇木素復染。采集圖像，每張切片選取3張400倍照片，使用IPP6.0軟件進行光密度分析，以平均光密度表示各蛋白表達水平。

1.7 突觸超微結構的形態(tài)學觀察 每組選擇3只大鼠，10%水合氯醛（0.35g·kg-1）腹腔注射麻醉后，斷頭處死，立即快速剝離腦組織，沿視交叉前端作冠狀切面，取大鼠左側(cè)大腦海馬CA1區(qū)組織3塊，組織塊約1mm3大小，經(jīng)固定、漂洗、脫水、滲透、包埋后以超薄切片機制作60～80nm切片。鈾鉛雙染色，干燥過夜后透射電鏡下觀察突觸情況。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示。兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學改變比較 水迷宮實驗最初2d，各組大鼠逃避潛伏期及逃避距離沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。第3天開始，假手術組大鼠逃避距離及逃避潛伏期與模型組相比下降較多，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。第4天藥物組大鼠逃避距離及逃避潛伏期下降較快，與假手術組接近，二者與模型組相比均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.05）。見表 1、2。在空間搜索實驗中，假手術組及藥物組大鼠跨越平臺次數(shù)均多于模型組（P＜0.01，P＜0.05），平臺所在象限游行時間及游行距離也多于模型組（P＜0.05，P＜0.01），但 3組大鼠的總游行距離及速度無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表3。

表1 各組大鼠逃避距離比較（±s,cm）Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

表1 各組大鼠逃避距離比較（±s,cm）Tab.1 Comparison of escaping latency among different groups(±s,cm)

注：與模型組相同時點比較，*P＜0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P＜0.05.

表2 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s,s）Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

表2 各組大鼠逃避潛伏期比較（±s,s）Tab.2 Comparison of escaping latency among different groups(±s,s)

注：與模型組相同時點比較，*P＜0.05。Note:Compared with model group at the same time,*P＜0.05.

表3 各組大鼠空間搜索實驗結果比較（±s）Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

表3 各組大鼠空間搜索實驗結果比較（±s）Tab.3 Comparison of the parameters of probing test among different groups(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 各組大鼠海馬突觸相關蛋白表達比較 藥物組及假手術組大鼠MAP-2蛋白表達高于模型組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01，P＜0.05），而且藥物組高于假手術組（P＜0.01）。藥物組大鼠SYP蛋白表達明顯高于模型組及假手術組（P＜0.01，P＜0.01），而且藥物組明顯高于假手術組（P＜0.01）。藥物組及假手術組大鼠PSD-95 蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.01，P＜0.01），而且藥物組高于假手術組（P＜0.01）。見圖1、表4。

2.3 各組大鼠突觸的超微病理學分析 從電鏡圖像可以看出，假手術組突觸結構完整，突觸間隙清晰可見，突觸前后膜間吻合良好，突觸后膜可見均勻增厚，突觸曲面弧度規(guī)整，突觸小泡豐富，線粒體結構完整；模型組突觸間隙消失，突觸前后膜界限模糊，弧度不規(guī)則，突觸小泡較少，線粒體嵴腫脹甚至消失；藥物組突觸結構疾病正常，突觸間隙清晰可見，突觸后膜均勻增厚，突觸小泡較多，線粒體結構完整、豐富。見圖2。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)MAP-2、SYP、PSD-95的表達（400×）Fig.1 Expression of MAP-2,SYP,PSD-95 in hippocampus among different groups(400×)

表4 各組大鼠海馬突觸相關蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

表4 各組大鼠海馬突觸相關蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison of expression of synaptic associated proteins among different group(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，##P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with sham-operated group,##P＜0.01.

3 討論

VD是最常見的認知功能障礙病因之一，屬中醫(yī)“文癡”“呆病”“善忘”“郁證”等范疇?！夺t(yī)方集解》言：“人之精與志，皆藏于腎。腎精不足則志氣衰，不能上通于心，故迷惑善忘也?！盵8]因此腎虛，腎中精氣不足可影響到心神而導致癡呆。此外，《靈樞·平人絕谷》言“血脈和利，精神乃居”，進一步指出血脈通暢是精神、情智、認知正常的必要條件。因此，治療VD多以補腎填精、健脾益氣、疏通經(jīng)絡等方藥配伍而獲良效。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸結構透射電鏡圖像Fig.2 The synaptic images of three groups observed with TEM

MDP組方中以山藥為君，重在補腎益氣；以熟地黃、何首烏、全當歸為臣，加強補腎填精、活血通絡、滋陰養(yǎng)血的功效，補而不滯；另以杜仲、川芎為佐，進一步加強補腎通絡功效，再佐以西黨參、茯苓、白術益氣健脾，意為補后天之本以促先天之本功能健旺；以白芍、枸杞、菖蒲、遠志、五味子為使調(diào)肝寧神，同時秉承肝腎同源、精血互化理論，從而達到滋陰潤燥、調(diào)攝精神之功效。諸藥合用，使腎氣健旺、腦絡通順、五臟得調(diào)，自當五神各安其位、五體靈活、五官靈敏而反應如常。

大鼠和人類一樣，具有完整的Willis環(huán)，因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型。雙側(cè)頸總動脈阻斷后可導致大鼠海馬慢性供血不足。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對缺血、缺氧損害極其敏感[7]，頸總動脈阻斷導致的缺血缺氧性病變勢必導致神經(jīng)元凋亡及突觸的變性和丟失，使突觸數(shù)量下降，可塑性降低，突觸相關蛋白表達發(fā)生改變，并進一步影響突觸的結構與功能。研究表明，突觸相關蛋白可調(diào)控突觸的生長、發(fā)育、成熟，并與突觸可塑性密切相關，當其表達發(fā)生改變后可使個體產(chǎn)生神經(jīng)精神癥狀，出現(xiàn)焦慮、感覺與認知功能受損、交流缺陷以及社會活動缺陷等[9]，因此突觸相關蛋白的表達是突觸數(shù)量及功能狀態(tài)的標志，能夠從微觀層面反映突觸的病理生理變化。

本研究發(fā)現(xiàn)，MDP能明顯改善VD大鼠的學習記憶能力。免疫組化檢測則進一步證實MDP能明顯促進突觸相關蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表達，藥物組明顯高于模型組及假手術組。SYP是一種突觸前囊泡特定蛋白，由313個氨基酸組成，分子量38kDa，對突觸形成和突觸功能的維持意義重大，是突觸重建的重要標志。SYP可作為突觸結構的標記物，在神經(jīng)外科手術中常用來標記突觸終末，避免神經(jīng)損傷[10]。MAP-2主要表達在神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘和突觸后致密區(qū)，作為神經(jīng)元樹突生長的標志蛋白，與突觸可塑性與樹突棘的形態(tài)與功能密切相關，在神經(jīng)元突起形成和突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[11]，與癲癇等疾病密切相關。PSD-95是一種由724個氨基酸構成的突觸后蛋白，與突觸的可塑性、學習記憶等相關，其變異可導致個體智能障礙。PSD-95參與了樹突棘的生長、發(fā)育、分支及成熟，在突觸信號修飾方面也發(fā)揮作用[12]。神經(jīng)元PSD-95的表達增多和突觸興奮性增強相關[13]，而AD及輕度認知障礙（minimal cognitive impairment，MCI）患者的神經(jīng)元PSD-95表達則明顯下降。

本研究中藥物組MAP-2表達增高說明MDP可促進樹突形成，從而促進新突觸形成，改善突觸可塑性，增強大鼠的學習和記憶能力；另一方面，藥物組大鼠SYP與PSD-95也明顯升高，說明MDP能夠保存現(xiàn)有突觸，并促進了突觸重建與再生，從而保護了缺血缺氧損傷的神經(jīng)組織。PSD-95與MAP-2表達增加，也提示神經(jīng)元樹突的生成和樹突棘的增多和成熟，為突觸重建創(chuàng)造了條件。電鏡觀察也證實MDP治療后大鼠突觸結構正常，尺寸增大，突觸囊泡豐富，這些為神經(jīng)信息的高效傳遞和處理創(chuàng)造了物質(zhì)條件。模型組突觸間隙消失，突觸前后膜界限不清，正常曲面消失，突觸囊泡減少或消失，線粒體嵴腫脹及破壞。相應的SYP、MAP-2、PSD-95表達均顯著低于假手術組及藥物組，表明突觸破壞、萎縮乃至消失，與其學習記憶能力降低不無關聯(lián)。

綜上所述，MDP通過補腎填精、益氣通絡，使腎氣健旺、腦絡通順、五臟得調(diào)，從而改善VD患者的認知功能。動物實驗證實該方能促進突觸再生，增強突觸相關蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表達，保證了突觸正常的生理結構和功能，為高效有序地處理神經(jīng)信息提供了物質(zhì)基礎。本研究結果為MDP在臨床上的推廣應用提供了進一步的實驗依據(jù)。

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