透明質(zhì)酸-膠原-生物玻璃支架材料的制備及礦化性能研究

楊春蓉

(福建工程學院 材料科學與工程學院， 福建 福州 350118)

生物活性玻璃(Bioglass, BG)是一類廣泛用于骨修復的無機活性材料，可與自然組織形成骨鍵合。但它的脆性大、彎曲強度低，在生理環(huán)境中的疲勞破壞強度不高[1]。膠原(Collagen,COL)是天然骨基質(zhì)的主要有機成分,具有較好的剛性和抗張能力[2]。因此，將生物活性玻璃與膠原復合，有望提高支架材料整體的力學性能。此外，透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HYA)是一種多陰離子化合物，存在于脊椎動物的連接組織、關(guān)節(jié)的滑液和軟骨中，對于細胞外液中Ca2+，Mg2+，K+，Na+等陽離子有較大親和力。因此，透明質(zhì)酸與鈣化有密切的關(guān)系。多種方法證明鈣化的比尚未鈣化的組織中透明質(zhì)酸的含量明顯降低[3]。

本實驗將生物活性玻璃、膠原、透明質(zhì)酸三者結(jié)合，綜合各自的優(yōu)勢，制備具有較好礦化性能的復合骨支架材料，并探討生物分子在礦化過程中的作用機制。

1 實驗

1.1 材料

58S生物活性玻璃采用溶膠-凝膠法自制； I 型牛膠原溶液濃度為5.8 mg/mL, pH 5.0；透明質(zhì)酸。

1.2 BG-COL-HYA復合支架的制備

準確稱量Ι型膠原蛋白溶液和透明質(zhì)酸，將其按8∶1的質(zhì)量比混合, 在攪拌狀態(tài)下將自制的生物活性玻璃粉體緩慢加入上述溶液中, 攪拌均勻, 生物活性玻璃與膠原蛋白的質(zhì)量比為65∶35; 待上述混合物攪拌均勻后, 加入交聯(lián)劑(1.25 mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺碳二亞胺和5 mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)); 隨后, 將裝有混合物的燒杯冷凍干燥得最終樣品。

1.3 BG-COL-HYA復合支架在模擬體液中的礦化實驗

2 結(jié)果與討論

2.1 支架的顯微結(jié)構(gòu)

圖1為BG-COL-HYA支架的SEM顯微形貌圖。從圖中可看出，生物活性玻璃顆粒包裹在膠原蛋白-透明質(zhì)酸復合物中。顆粒間通過纖維狀的有機大分子相連。支架具有相互交錯、連續(xù)的不規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小在幾微米到400 μm間分布。這種結(jié)構(gòu)可為細胞生長及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生提供充分的空間。

圖1 BG-COL-HYA支架的顯微形貌圖Fig.1 Microtopography of BG-COL-HYA scaffolds

2.2 支架的礦化性能

圖2為支架在SBF溶液中分別礦化1、2、3d的SEM顯微形貌圖。從圖中可見，在礦化初期，支架表面首先形成小的礦物晶體，隨后這些晶體進一步聚集長大；且當長到一定程度時與鄰近的晶體融合，生長成尺寸更大的球狀晶體。

(a)礦化1d

(b)礦化2d

(c)礦化3d圖2 BG-COL-HYA支架在SBF溶液中礦化不同時間的顯微形貌圖Fig.2 Microtopography of BG-COL-HYA scaffolds at different time during mineralization in SBF solution

圖3為BG-COL-HYA支架在SBF中浸泡不同時間的XRD圖，從圖譜分析可以看出，支架材料礦化前無晶相的特征峰，僅在32°衍射角附近出現(xiàn)了較寬的生物玻璃衍射峰。隨著浸泡時間延長，逐漸出現(xiàn)了羥基磷灰石的特征峰，且強度逐漸增大。在SBF溶液中浸泡3d后，支架出現(xiàn)典型的羥基磷灰石特征峰。表明支架材料在SBF溶液中逐漸礦化形成的球狀物為羥基磷灰石晶體。

圖3 BG-COL-HYA支架在SBF中礦化不同時間的XRD圖譜Fig.3 XRD spectra of BG-COL-HYA scaffolds at different time during mineralization in SBF solution

圖4是BG-COL和BG-COL-HYA支架在SBF溶液中的質(zhì)量變化情況。從圖中可看出，兩種支架在SBF溶液中既有礦化過程也有降解過程。在初始階段，降解速率遠大于礦化速率，支架的質(zhì)量急劇降低。隨著時間延長，礦化與降解處于相對平衡狀態(tài)，支架的質(zhì)量穩(wěn)定。相比之下，BG-COL-HYA支架處于平衡狀態(tài)時的質(zhì)量高于BG-COL支架。這表明BG-COL-HYA支架的礦化量高于BG-COL支架。

圖4 BG-COL和BG-COL-HYA支架在SBF溶液中的質(zhì)量變化Fig.4 Mass changes of BG-COL and BG-COL-HYA scaffolds in SBF solution

從材料學角度看，自然骨組織是包含有機材料和無機材料的復合體，且具有精巧而復雜的分級結(jié)構(gòu)。骨形成過程中，首先由細胞分泌膠原蛋白分子，之后，膠原蛋白分子在細胞外組裝成模板，緊接著體液中的礦物分子或離子沉積在膠原模板上形成以羥基磷灰石為主的礦物。膠原蛋白在礦化的初始階段起著重要作用。天然骨中的羥基磷灰石晶體呈片狀或針狀，并在膠原纖維組裝成的凹槽內(nèi)規(guī)整排列，因而可以認為在無機物沉積過程中膠原起著晶核的作用，而晶核是啟動結(jié)晶的位點。首先是磷酸根然后是鈣離子結(jié)合到成核點上[4]。膠原纖維的這種活性功能可能來自于兩方面：膠原分子獨特的規(guī)則排列結(jié)構(gòu)，以及因其側(cè)鏈的特定集合而引起的電化學和立體化學影響[5-6]。

但膠原蛋白本身不能完成基質(zhì)的全部功能。天然骨中膠原纖維的周期性規(guī)整孔區(qū)僅是沉積磷酸鈣晶體的模板，孔區(qū)或附近結(jié)合的某些非膠原蛋白，如糖蛋白、磷蛋白及富含羧基谷氨酸或羥基脯氨酸才是指導和促發(fā)礦化的物質(zhì)，它們提供晶核形成的位點并調(diào)控晶體生長的取向，既可與膠原蛋白靜電匹配，又能與鈣離子強配位結(jié)合，因此起著橋接膠原與礦物的作用[7]。

透明質(zhì)酸是糖蛋白的一種，也是多陰離子化合物，其所帶的負電荷官能團羧基可與膠原的羧基形成共價鍵。羥基磷灰石晶體的礦化過程是一種異相成核過程。此過程要求大分子上成核部位的原子排列與所形成的固相晶格匹配。透明質(zhì)酸與膠原的共價結(jié)合有助于提高該復合分子與固相晶格的匹配，降低成核活化能。實驗中發(fā)現(xiàn)，在BG-COL生物活性骨組織工程支架中添加透明質(zhì)酸后，其礦化量也有所上升，其原因就在于透明質(zhì)酸所帶的負電荷官能團羧基不僅可以靜電結(jié)合大量的鈣離子，而且可以共價結(jié)合膠原，促進鈣化。

3 結(jié)論

以透明質(zhì)酸、膠原和生物玻璃制備了一種復合支架材料，并研究了其體外礦化性能。研究表明，支架在礦化過程中可形成羥基磷灰石晶體；膠原蛋白和透明質(zhì)酸對溶液中鈣、磷離子的親和力構(gòu)成了礦化機制的基礎(chǔ)；且兩種生物分子可相互鍵合，促進鈣化。

參考文獻：

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[2] ZHU Y, WAN Y, ZHANG J, et, al. Manufacture of layered collagen/chitosan-polycaprolactone scaffolds with biomimetic microarchitecture[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2014,113:352-360.

[3] 張文強,黃岳山,支曉興.透明質(zhì)酸在臨床醫(yī)學中的應(yīng)用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(23):4515-4518.

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[5] MOUW J K, OU G, WEAVER V M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(12):771-785.

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[7] VEIS A, DORVEE J R. Biomineralization Mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matricies[J]. Calcif Tissue Int,2013,93(4):307-315.