云南松松塔提取物體外抗肺癌活性研究

劉 熙，于冬梅，陳進(jìn)汝，高 波，李冬梅，李春艷

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

肺癌為肺部原發(fā)性惡性腫瘤，絕大多數(shù)起源于支氣管粘膜上皮，2014年美國癌癥協(xié)會最新報(bào)告顯示〔1〕，肺癌占男性新增病例的第二位，僅次于前列腺癌；占女性新增病例的第二位，僅次于乳腺癌。盡管多種化療藥物的發(fā)現(xiàn)和放療技術(shù)的改進(jìn)，以及近年來生物藥物的發(fā)現(xiàn)，使肺癌的治療取得了一定的進(jìn)展，但是相較于其他腫瘤而言，其發(fā)病率和死亡率仍居高不下〔2-3〕。因此，尋找一種新的高效低毒的抗腫瘤藥物，增強(qiáng)肺癌的治療療效，改善患者的生活質(zhì)量尤為迫切。

云南松松塔是松科松屬植物云南松（Pinus yun?nanensis Franch.）的球果，藥用歷史悠久，《本草綱目》中記載其具有抗病毒、祛痰、止咳平喘、祛風(fēng)潤腸、安神和鎮(zhèn)靜等功效〔4〕?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，云南松松塔具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用〔5〕。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，松科屬植物具有一定的抗癌活性〔6-9〕，但未見云南松松塔提取物對肺癌的影響。故本研究選擇肺癌細(xì)胞株（NCI-H661、NCI-H157、NCI-H292、SK-MES-1、A549）進(jìn)行體外抗腫瘤活性物質(zhì)篩選，考察云南松松塔提取物對肺癌細(xì)胞增殖作用的影響。在此基礎(chǔ)上，探討云南松松塔提取物對人正常肺細(xì)胞（MRC-5）的毒性作用，篩選出對肺癌細(xì)胞抑制作用好且對人正常肺細(xì)胞毒性小的活性成分，為云南松松塔抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)一步研究及云南松松塔的藥用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 云南松松塔樣品 云南松松塔采自大理州漾濞縣，經(jīng)大理大學(xué)生藥教研室夏從龍教授鑒定為松科松屬植物云南松（Pinus yunnanensis Franch.）的松塔。樣品標(biāo)本保存于大理大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室。ST-D：醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液，一倍醇溶后得到ST-D（得率0.03%）；ST-E：濾液兩倍醇沉后過濾得沉淀ST-E（得率0.09%）；ST-F：濾液兩倍醇溶得到的濾液再五倍醇溶得到的沉淀ST-F（得率0.10%）；ST-DEF：醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液，一次五倍醇溶，過濾，得沉淀ST-DEF（得率0.78%）。在本實(shí)驗(yàn)中，樣品ST-D、ST-E、ST-F、STDEF均用DMEM培養(yǎng)基溶解。

1.2 細(xì)胞株 NCI-H661：人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞；NCIH157：人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞；NCI-H292：人肺癌細(xì)胞；SK-MES-1：人肺鱗癌細(xì)胞；A549：人肺腺癌細(xì)胞；MRC-5人正常肺細(xì)胞，均購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細(xì)胞庫。

1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）均購自Gibco公司；0.25%胰蛋白酶（Thermo公司）；噻唑藍(lán)（MTT）、Hepes、雙抗（青霉素100 mg∕L，鏈霉素100 mg∕L）、二甲基亞砜（DMSO）均購自Sigma公司；順鉑（DDP，粉針劑，山東羅欣藥業(yè)股份有限公司）；Yj-1450無菌操作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；IX-7倒置相差顯微鏡（Olympus）；水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Es-315高壓滅菌器（日本Tomykogyo公司）；連續(xù)波長酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）。

2 方法

2.1 樣品配制 將ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF粉末及DDP用含10%滅活FBS的DMEM培養(yǎng)基溶解，0.22 μm的濾膜過濾，配制成終濃度為1 mg∕mL的溶液，試驗(yàn)時(shí)稀釋成濃度梯度溶液。

2.2 云南松松塔提取物對人肺癌細(xì)胞增殖的影響肺癌細(xì)胞（NCI-H292、NCI-H661、SK-MES-1、A549、NCI-H157）分別用含10%滅活FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，離心，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度至1×105個(gè)∕mL，接種于96孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄去上清液后，分別于每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔中加入濃度梯度（終濃度分別為1 000.00、250.00、62.50、15.63、3.91、0.98 μg∕mL）云南松松塔提取物樣品溶液（STD、ST-E、ST-F、ST-DEF），每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陽性對照組（DDP）、陰性對照組和空白對照組。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，棄去上清液，加入MTT溶液（5 mg∕mL）20 μL∕孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，分別加入DMSO溶液150 μL∕孔，待紫色結(jié)晶溶解后，在波長570 nm檢測各孔OD值，按下式計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=［1-（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）（∕OD陰性-OD空白）］×100%

2.3 云南松松塔提取物對MRC-5細(xì)胞的作用取對數(shù)生長期MRC-5細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，離心，棄去上清液，完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度至1×105個(gè)∕mL，接種于96孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄去上清液后，加入云南松松塔提取物濃度同“2.2”，同時(shí)設(shè)置陰性對照組和空白對照組。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，棄去上清液，每孔加入5 mg∕mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，再分別加入DMSO溶液150 μL，待紫色結(jié)晶溶解后，在波長570 nm檢測各孔OD值，按下式計(jì)算出存活率。

存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)-OD空白）（∕OD陰性-OD空白）×100%

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差齊性檢驗(yàn)后用單因素方差分析（one-way ANVOA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 云南松松塔提取物作用72 h時(shí)對人肺癌細(xì)胞增殖的影響 云南松松塔提取物72 h對人肺癌細(xì)胞增殖的影響見表1、圖1。與陰性對照組比較，云南松松塔4個(gè)提取物在1 000.00 μg∕mL時(shí)均對NCIH292、NCI-H661、A549、SK-MES-1、NCI-H157 細(xì)胞增殖有抑制作用，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。云南松松塔4個(gè)提取物中，ST-D和ST-E在相同質(zhì)量濃度梯度下，ST-E對NCI-H292、NCIH661、A549、NCI-H157細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于STD，而隨著云南松松塔提取物醇溶倍數(shù)的增加，STF對以上肺癌細(xì)胞株的抑制作用在相同質(zhì)量濃度梯度下弱于ST-D、ST-E；采用醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液經(jīng)一次五倍醇溶過濾后得到的ST-DEF對NCI-H661細(xì)胞的抑制作用與ST-F對NCI-H661的抑制作用相差不大，而ST-DEF對肺癌細(xì)胞株（NCI-H292、A549、SK-MES-1、NCIH157）的抑制作用強(qiáng)于ST-F；ST-DEF和ST-D對NCI-H661、A549、SK-MES-1的抑制作用相差不大，但ST-DEF對肺癌細(xì)胞株NCI-H292、NCI-H157細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于ST-D；ST-DEF和ST-E對肺

癌細(xì)胞株NCI-H292、SK-MES-1、NCI-H157細(xì)胞相差不大，但ST-E對NCI-H661、A549細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于ST-DEF。提示提取工藝的不同對肺癌細(xì)胞株增殖的抑制作用有所不同。云南松松塔各提取物在不同質(zhì)量濃度梯度下與陽性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與陰性對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明云南松松塔提取物有體外抗肺癌作用但作用弱于DDP（陽性對照組）。

3.2 云南松松塔提取物72 h時(shí)對MRC-5細(xì)胞的作用

表1 72 h時(shí)云南松松塔提取物對人肺癌細(xì)胞增殖作用的影響（xˉ±s，n=3）

圖1 云南松松塔提取物對肺癌細(xì)胞的抑制作用

在觀察云南松松塔提取物72 h時(shí)對人肺癌細(xì)胞增殖影響的基礎(chǔ)上，同時(shí)考察云南松松塔提取物對人正常肺細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞）的影響，以期篩選出活性高、毒性小的抗腫瘤活性提取物。從表2中結(jié)果可知：云南松松塔提取物在不同質(zhì)量濃度與MRC-5細(xì)胞共同孵育72 h后，在1 000.00 μg∕mL時(shí)，ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF對MRC-5細(xì)胞的存活率分別為（70.68± 0.01）%、（73.82±0.00）%、（71.91±0.01）%、（73.11±0.04）%。提示在云南松松塔提取物ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF對人正常肺細(xì)胞的毒性小（見表2）。云南松松塔各提取物在不同質(zhì)量濃度下與DDP比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明DDP對MRC-5細(xì)胞毒性大于云南松松塔各提取物。見圖2。

4 討論

肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC約占所有肺癌的85%，主要包括鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）、腺癌和大細(xì)胞癌。目前NSCLC治療的主要方法包括手術(shù)、放療、化療及生物治療等，但由于大部分的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，患者5年生存率很低。因此，探索肺癌的發(fā)病原因及尋找有效的治療靴點(diǎn)，對于肺癌的治療起到積極的推動作用。

圖2 云南松松塔提取物對正常人肺細(xì)胞的存活率

表2 72 h時(shí)云南松松塔提取物對人正常肺細(xì)胞的毒性作用（xˉ±s，n=3）

我國中藥資源豐富，中醫(yī)藥在治療腫瘤方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，療效顯著，無明顯不良反應(yīng)，且具有多靶點(diǎn)、多部位、多途徑、多效應(yīng)、價(jià)格低廉、效果明顯、易于普及等優(yōu)點(diǎn)〔10〕。從我國國情出發(fā)，利用中醫(yī)藥的獨(dú)特性及經(jīng)濟(jì)性，開發(fā)傳統(tǒng)的具有我國特色的抗肺癌藥物或抗肺癌輔助藥物是完全可能和可行的。松科松屬植物多為常綠喬木，稀為灌木，北極地區(qū)、北非、中美、中南半島、蘇門答臘赤道以南地方均有分布；松屬我國產(chǎn)22種10變種，引入16種2變種，遍布全國各地〔11〕。云南松主要分布于云南，資源十分豐富。近年來，國內(nèi)外已有多位學(xué)者對不同松科植物進(jìn)行了研究，如發(fā)現(xiàn)日本五針?biāo)伤伤械哪举|(zhì)素與糖的結(jié)合體具有抗腫瘤活性〔12〕，紅松松塔、紅松球果鱗片具有一定的抗癌活性〔13〕。這些研究提示云南松松塔中可能有抗癌作用的成分。故本文從細(xì)胞水平探討云南松松塔提取物（ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF）對人肺癌細(xì)胞（包括小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株）增殖的影響和人正常肺細(xì)胞的作用，結(jié)果表明：云南松松塔4個(gè)提取物中，ST-D和ST-E在相同質(zhì)量濃度梯度下，ST-E對NCI-H292、NCI-H661、A549、NCI-H157的抑制作用強(qiáng)于ST-D，提示隨著醇溶倍數(shù)的增加，活性成分并未損失，且對NCI-H292、NCI-H661、A549、NCI-H157肺癌細(xì)胞株的抑制作用增強(qiáng)，而隨著云南松松塔提取物醇溶倍數(shù)增加至五倍醇溶得到的ST-F對肺癌細(xì)胞株NCI-H292、NCI-H661、A549、SK-MES-1、NCI-H157的抑制作用在相同質(zhì)量濃度梯度下均弱于ST-D、ST-E，提示其抗肺癌活性部位主要集中在ST-E中；另外改變提取工藝，采用醇提水沉后經(jīng)堿提酸沉法得到的濾液經(jīng)一次五倍醇溶過濾后得到的STDEF對NCI-H661的抑制作用與ST-F相差不大，但相同質(zhì)量濃度梯度下ST-DEF對NCI-H292、A549、SK-MES-1、NCI-H157的抑制作用強(qiáng)于ST-F；此外 ST-DEF和 ST-D 對 NCI-H661、A549、SKMES-1的抑制作用相差不大，但ST-DEF對肺癌細(xì)胞株NCI-H292、NCI-H157的抑制作用強(qiáng)于ST-D；ST-DEF和ST-E對肺癌細(xì)胞株NCI-H292、SKMES-1、NCI-H157相差不大，但ST-E對NCI-H661、A549的抑制作用強(qiáng)于ST-DEF。提示改進(jìn)工藝后得到的ST-DEF都含有抑制肺癌細(xì)胞NCI-H292、NCI-H661、A549、SK-MES-1、NCI-H157的活性成分，ST-DEF某些成分對抑制肺癌細(xì)胞NCI-H292、NCI-H157增殖的作用強(qiáng)于ST-D，而某些成分抑制肺癌細(xì)胞NCI-H661、A549增殖的作用弱于ST-E。由此確定云南松松塔抗肺癌活性部位為ST-DEF。在本試驗(yàn)中，云南松松塔各提取物在不同質(zhì)量濃度梯度下與陽性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與陰性對照組比較，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明云南松松塔提取物有體外抗肺癌作用但作用弱于DDP（陽性對照組）。云南松松塔各提取物中抗肺癌活性組段是否存在活性更強(qiáng)的單體，有待進(jìn)一步對其活性組段進(jìn)行提取、分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定及體內(nèi)外相關(guān)的藥效研究。除此外，考察云南松松塔提取物對人正常肺細(xì)胞（STDEF）的毒性作用，篩選得到抗癌活性高、對肺細(xì)胞毒性小的提取物，進(jìn)而有利于后續(xù)研究及臨床應(yīng)用，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知在高濃度（1 000.00 μg∕mL）下，ST-D、ST-E、ST-F、ST-DEF對MRC-5細(xì)胞的存活率分別為（70.68±0.01）%、（73.82± 0.00）%、（71.91±0.01）%、（73.11±0.04）%。其余濃度下對MRC-5細(xì)胞均無毒性作用。云南松松塔各提取物在不同質(zhì)量濃度下與DDP比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明DDP對MRC-5細(xì)胞毒性大于云南松松塔各提取物，DDP對MRC-5細(xì)胞毒性作用大也再次說明DDP抗腫瘤作用與細(xì)胞毒性有關(guān)。

綜上所述，云南松松塔4個(gè)提取物中，ST-E和ST-DEF為抗肺癌活性較好組段，且在高濃度下對人正常肺細(xì)胞毒性小。目前，本課題組正在對云南松松塔提取物的活性部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以期從中篩選出具有抗肺癌活性的化合物，并闡明其作用機(jī)制。

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