徐 盈,宋婷婷,張 玲,鄭 嬌,徐 慧,程 璐,陳必良,張建芳

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032;*

胎兒股骨長(zhǎng)度是用來(lái)評(píng)估妊娠齡大小、評(píng)估胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)狀況的重要數(shù)值。股骨偏短是指對(duì)于股骨測(cè)量值低于平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)差以上,是妊娠期較常見的超聲表現(xiàn)[1]。股骨偏短與物理、化學(xué)因素、染色體異常、基因突變及其妊娠期營(yíng)養(yǎng)等諸多因素相關(guān)。對(duì)股骨偏短胎兒進(jìn)行準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷及其咨詢是十分必要的,為此本研究總結(jié)了25例股骨偏短的胎兒產(chǎn)前診斷的臨床資料,為該類胎兒產(chǎn)前咨詢提供臨床指導(dǎo)資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2016-10～2017-10西京醫(yī)院婦產(chǎn)科接診的超聲診斷胎兒股骨偏短指征孕婦的臨床資料。

1.2 超聲檢查

本報(bào)道中所有病例的超聲測(cè)量均采用奧地利GE Voluson E8的彩色多普勒超聲診斷儀,必要時(shí)須4-6周復(fù)查1次,產(chǎn)后對(duì)新生兒的結(jié)局作相應(yīng)記錄。

1.3 胎兒樣本采集

超聲診斷股骨短小的孕婦在簽署知情同意書的情況下,在無(wú)菌消毒條件下,孕婦排空膀胱,平臥位,找好穿刺點(diǎn)及穿刺方向,消毒鋪無(wú)菌洞巾,在超聲診斷儀引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù),一次性無(wú)菌注射器緩慢抽取羊水25 ml。

1.4 染色體核型分析

將15 ml新鮮抽取的羊水在1 500 r/min,離心5 min,超凈工作臺(tái)內(nèi)去上清,加入CHANG Amnio培養(yǎng)基(Irvine Scientific公司)靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行羊水細(xì)胞的培養(yǎng)7 d換液,經(jīng)過(guò)多次觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,待細(xì)胞長(zhǎng)出大的克隆后收集細(xì)胞,進(jìn)行制片以及G顯帶核型分析。

1.5 染色體微陣列分析技術(shù)(chromosomal microarray analysis,CMA)

采用西安天隆有限公司的NP986-S全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)提取絨毛,羊水和外周血DNA,采用分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)。-20 ℃保存?zhèn)溆?。CMA檢測(cè)根據(jù)Affymetrix公司CytoScanTM 750 k芯片檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行,依次包括酶切、連接、擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記、雜交及掃描,掃描與分析,應(yīng)用ChAS軟件(Chrosome Analysis Suite)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。并根據(jù)DGV,DECIPHER,OMIM,UCSC,ISCA,NCBI等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 FGFR3基因檢測(cè)

FGFR3基因外顯子引物序列見參考文獻(xiàn)[2],由西安擎科生物公司合成,PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 30 s;退火61 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s(循環(huán)32次);最后延伸72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送西安擎科生物有限公司直接測(cè)序。

1.7 隨訪

在我院進(jìn)行產(chǎn)檢和出生的胎兒通過(guò)門診進(jìn)行隨診;其他通過(guò)電話進(jìn)行定期隨訪。

2 結(jié)果

2.1 胎兒股骨短小的檢測(cè)結(jié)果

首先采用染色體核型分析技術(shù)對(duì)25例胎兒股骨短小的樣本進(jìn)行檢測(cè):共檢測(cè)出2例胎兒(病例5,25)染色體核型異常,均為21-三體綜合征。1例胎兒(病例3)染色體存在微缺失異常,即在7號(hào)染色體長(zhǎng)臂q31.32位置發(fā)生317 kb的缺失(染色體物理位置:122069392-122386475)。通過(guò)FGFR3基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4例胎兒(病例1,4,7,12)發(fā)現(xiàn)胎兒樣本存在c.1138G>A點(diǎn)突變,導(dǎo)致編碼氨基酸改變Gly380Arg,檢測(cè)結(jié)果在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索分析,c.1138G>A(p.Gly380Arg)改變與軟骨發(fā)育不全密切相關(guān)(見表1)。

2.2 妊娠結(jié)局及隨訪

檢出異常胎兒7例均已引產(chǎn),18例超聲異常而產(chǎn)前基因診斷正常者有1例胎兒宮內(nèi)缺氧引產(chǎn),2例胎兒股骨長(zhǎng)嚴(yán)重不符合實(shí)際孕周,家屬要求引產(chǎn),引產(chǎn)兒股骨測(cè)量結(jié)果與孕晚期B超結(jié)果相一致,12例出生后隨訪生長(zhǎng)發(fā)育未見異常,3例失訪(見表1)。

表125例胎兒股骨短小遺傳檢測(cè)分析結(jié)果

Table1Analysisofshortgeneticanalysisof25casesoffetalfemur

編號(hào)孕周檢查指征核型結(jié)果CMA結(jié)果 FGFR3 檢測(cè)結(jié)果 隨訪 結(jié)果 134+2周胎兒先天發(fā)育異常,右腎多囊泡發(fā)育不良,合并右側(cè)輸尿管擴(kuò)張,雙頂徑相當(dāng)于孕35周,股骨長(zhǎng)6.2 cm,相當(dāng)于孕32周46,XNarr(1-22)×2,(XY)×1雜合c.1138G>A(Gly380Arg)引產(chǎn)233周羊水過(guò)多,胎兒雙腎回聲增強(qiáng),雙頂徑測(cè)定值相當(dāng)于孕33周,股骨長(zhǎng)發(fā)育相當(dāng)于孕27+5周46,XNarr[hg19]16p11.2(32524764-34203803)×3;arr[hg19]Yq11.23(26527669-27456495)×0(良性)未見異常正常324周雙頂徑相當(dāng)于孕18+5周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕19+3周46,XNarr[hg19] 7q31.32(122069392-122386475)×1(致病)未見異常引產(chǎn)433周雙頂徑33周,股骨長(zhǎng)25周,肱骨長(zhǎng)24+2周46,XNarr(1-22)×2,(XX)×1雜合c.1138G>A(Gly380Arg)引產(chǎn)536+2周羊水偏多;胎兒右心系統(tǒng)比例增大,左心室強(qiáng)光點(diǎn);左側(cè)側(cè)腦室寬約1.4 cm,雙頂徑相當(dāng)于孕35+2周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕29+4周47,XN,+21arr(21)×3(致病)未見異常引產(chǎn)631周胎兒雙頂徑相當(dāng)于35周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于32周46,XNarr(1-22)×2,(XY)×1未見異常失訪728周胎兒四肢短小,相當(dāng)于23周46,XNarr(1-22)×2,(XY)×1雜合c.1138G>A(Gly380Arg)引產(chǎn)832周雙頂徑相當(dāng)于孕33+3周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于28周,肱骨長(zhǎng)相當(dāng)于27+3周46,XNarr(1-22)×2,(XY)×1未見異常正常929周雙頂徑相當(dāng)于孕26+1周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于24+5周,肱骨長(zhǎng)相當(dāng)于24+6周46,XNarr[hg19] Yq11.223q11.23(24631530-28464713)×2(可能良性)未見異常宮內(nèi)缺氧,引產(chǎn)

續(xù)表125例胎兒股骨短小遺傳檢測(cè)分析結(jié)果

Table1Analysisofshortgeneticanalysisof25casesoffetalfemur

編號(hào)孕周檢查指征核型結(jié)果CMA結(jié)果 FGFR3 檢測(cè)結(jié)果 隨訪 結(jié)果 1029周胎兒四肢短小,相當(dāng)于24+5周46,XNarr[hg19] Yq11.223q11.23(25838209-27809333)×2(可能良性)未見異常孕37周引產(chǎn),雙頂徑股骨長(zhǎng)嚴(yán)重不符1131+1周羊水偏多,雙頂徑相當(dāng)于孕34+5周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于28+4周46,XNarr(1-22)×2,(XY)×1未見異常正常1230周羊水偏多,羊水指數(shù)20.6,雙頂徑相當(dāng)于孕32周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕23周46,XNarr[hg19] 16p11.2(32564735-33863672)×4(可能良性)雜合c.1138G>A(Gly380Arg)引產(chǎn)1326周胎兒心臟強(qiáng)光點(diǎn),胎兒雙頂徑為孕29+3周,股骨長(zhǎng)孕26+6周46,XNarr(1-22)×2,(XY)×1未見異常失訪1431+3周胎兒雙頂徑相當(dāng)于孕31周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕24周46,XNarr(1-22)×2,(XY)×1未見異常失訪1527+5周單臍動(dòng)脈(右支缺如),雙頂徑相當(dāng)于孕30+5周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕27周46,XNarr(1-22)×2,(X,Y)×1未見異常正常1628+3周左側(cè)側(cè)腦室后角寬約0.82 cm,右側(cè)0.57 cm,雙頂徑相當(dāng)于孕28周46,XNarr[hg19] 7p11.2q11.21(57209596-63189414)×3(可能良性)未見異常正常1729+6周高齡,胎兒脊柱骶尾部顯示不清,雙頂徑相當(dāng)于孕28+6周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕23+6周46,XNarr[hg19] 7q11.21(64651296-65162169)×1(良性)未見異常正常1831周鼻骨未顯示,羊水過(guò)多,雙頂徑相當(dāng)于32周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于29周46,XNarr(1-22)×2,(X,Y)×1未見異常正常1928+1周雙頂徑相當(dāng)于孕28+3周,股骨、肱骨相當(dāng)于孕25+3周46,XNarr[hg19] Yq11.221(17721414-19782139)×2(意義不明確,可能良性)未見異常正常2027周胎兒雙頂徑相當(dāng)于孕29+2周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕23+6周,肱骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕26+2周46,XNarr(1-22)×2,(X,Y)×1未見異常正常2135周雙頂徑相當(dāng)于孕35+2周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕31+5周,肱骨相當(dāng)于孕30+1周,雙側(cè)腎盂輕度分離,下腹腸管局部回聲增強(qiáng)46,XNarr[hg19] 7q11.21(64612879-65148399)×1(良性)未見異常正常2227+2周完全性前置胎盤(輪狀胎盤可能),單臍動(dòng)脈(左支缺如),雙頂徑相當(dāng)于26+1周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于21+1周46,XNarr(1-22)×2,(X,Y)×1未見異常36周引產(chǎn),雙頂徑股骨長(zhǎng)嚴(yán)重不符2330周羊水偏少,雙頂徑相當(dāng)于孕28周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于27周,肱骨相當(dāng)于孕27周46,XNarr(1-22,X)×2未見異常正常2428周雙頂徑相當(dāng)于孕30周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕25+6周46,XNarr(1-22)×2,(X,Y)×1未見異常正常2528+4周側(cè)腦室增寬,左側(cè)側(cè)腦室寬約1.1 cm,右側(cè)側(cè)腦室寬約1.0 cm;顱后窩寬約0.8 cm;羊水過(guò)多;雙頂徑相當(dāng)于孕30+3周,股骨長(zhǎng)相當(dāng)于孕25周;胸腔積液47,XN,+21arr(21)×3(致病)未見異常引產(chǎn)

arr:芯片檢測(cè)結(jié)果描述;hg19:參考基因組版本19

3 討論

胎兒肢體畸形是骨骼系統(tǒng)畸形的一種,且發(fā)病率約為1/500[3]。胎兒股骨、肱骨長(zhǎng)度檢測(cè)是產(chǎn)前超聲檢測(cè)評(píng)估胎兒生長(zhǎng)發(fā)育一項(xiàng)重要的指標(biāo),通常在孕10周左右可看見小的肢體的芽形成,嚴(yán)重的肢體缺如此時(shí)也可通過(guò)超聲進(jìn)行早期診斷,當(dāng)雙頂徑達(dá)到3 cm左右,四肢長(zhǎng)骨清楚可見,且可測(cè)量。常規(guī)超聲篩查時(shí)期為18-24周,25-32周為查漏補(bǔ)缺期[4],誤診率較低。胎兒股骨短小是臨床中較常見的產(chǎn)前超聲診斷胎兒異常征象,常常會(huì)引起患者的焦慮心理,產(chǎn)科醫(yī)生在臨床處理中也存在諸多困惑。這就要求我們有正確的診斷思路,正確區(qū)分生理性股骨徑小于孕周和病理性股骨短小,還要進(jìn)一步明確各種引起股骨短小的可能病理因素,從而做出正確的相應(yīng)處理。

一般認(rèn)為,少數(shù)胎兒股骨偏短發(fā)生于孕中期,多數(shù)發(fā)生于孕晚期。為此,當(dāng)發(fā)現(xiàn)胎兒為股骨短小時(shí)通常再次核實(shí)孕周,在孕周準(zhǔn)確的情況下根據(jù)父母身高、孕婦孕期營(yíng)養(yǎng)狀況、有無(wú)妊娠期高血壓等情況,超聲進(jìn)行復(fù)查,必要時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)胎兒股骨生長(zhǎng)狀況。超聲復(fù)查股骨偏短程度有不斷加重或者合并其他多項(xiàng)畸形時(shí)建議進(jìn)一步的遺傳學(xué)診斷[5]。本組研究中25例胎兒股骨短小的病例中,孤立性股骨短小有11例,基因診斷異常3例,分別為病例3(股骨長(zhǎng)比實(shí)際孕周小5周)存在7號(hào)染色體長(zhǎng)臂q31.32位置發(fā)生317 kb的缺失,病例4(股骨長(zhǎng)比實(shí)際孕周小8周)和病例7(股骨長(zhǎng)比實(shí)際孕周小5周)存在FGFR3基因c.1138G>A(p.Gly380Arg)雜合突變。而股骨短小合并其他畸形有15例,檢測(cè)出異常5例,21三體2例,FGFR3基因c.1138G>A(p.Gly380Arg)雜合突變2例,可看出孤立性股骨短小與增加染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān),而股骨短小合并其他畸形時(shí)與遺傳因素有關(guān),這與Chaudhury等[6]報(bào)道結(jié)果相一致。

胎兒股骨短小是孕期超聲檢查發(fā)現(xiàn)的一種超聲“軟指標(biāo)”。超聲“軟指標(biāo)”是指超聲發(fā)現(xiàn)胎兒出現(xiàn)一類輕微病變或異常,其并非病理性指標(biāo),但可用于評(píng)估染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)[7]。本組研究中25例胎兒檢測(cè)到21-三體綜合征2例,檢出率為8%,與李莉等[8]報(bào)道相一致。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道21-三體胎兒中股骨短小病例占14%,而正常胎兒僅有6%的發(fā)生率[9]。Ville等[10]報(bào)道認(rèn)為長(zhǎng)骨短已經(jīng)是染色體異常的特征之一,常見于21-三體綜合征、三倍3體及Turner綜合征。國(guó)內(nèi)學(xué)者張國(guó)正等[5]在276例股骨短小胎兒中,發(fā)現(xiàn)有3例21-三體胎兒僅僅表現(xiàn)為股骨短小。

此外,許多骨骼發(fā)育不良和特征性綜合征與股骨短小相關(guān)[11],但是大多數(shù)病例可以發(fā)現(xiàn)同時(shí)合并多項(xiàng)超聲“軟指標(biāo)”。近年來(lái),CMA檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用尤其是在超聲檢查指標(biāo)異常的胎兒中已經(jīng)比較廣泛,能夠檢測(cè)出由染色體微缺失、微重復(fù)等細(xì)微結(jié)構(gòu)異常及單親二倍體所導(dǎo)致的胎兒異常表現(xiàn)。在本研究中,病例3檢出7號(hào)染色體7q31.32區(qū)域發(fā)生371 kb的缺失,該缺失區(qū)域與國(guó)際公共良性CNVs數(shù)據(jù)庫(kù)(DGVs)無(wú)重疊,此區(qū)域包含CADPS2 OMIM致病基因,該基因突變與某種易感性自閉癥相關(guān),有文獻(xiàn)表明該區(qū)域缺失的患者患有自閉癥及智力發(fā)育遲緩等表現(xiàn)[12]。病例2,9,10,12,16,17通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行比對(duì)分析判斷所檢出CNVs的性質(zhì)均為良性。

另外,FGFR3突變可直接引起侏儒癥,其中包括季肋發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不全、致死性發(fā)育不全等,該基因突變導(dǎo)致的患者有肢體短小等特征[13],在本研究中,有4例胎兒(1,4,7,12)在FGFR3基因外顯子10發(fā)現(xiàn)c.1138G>A(p.Gly380Arg)雜合突變,該突變導(dǎo)致跨膜區(qū)第380位密碼子甘氨酸被精氨酸取代,致病性明確[14]。但是對(duì)于本組回顧分析中超聲異常而分子診斷分析無(wú)異常者18例,導(dǎo)致胎兒股骨短小及其合并其他畸形的原因尚不明確,仍需要進(jìn)一步的臨床隨診和診斷技術(shù)對(duì)胎兒進(jìn)行綜合性評(píng)估。

綜上所述,我們?cè)诋a(chǎn)前發(fā)現(xiàn)胎兒股骨短小合并兩項(xiàng)及以上異常時(shí),應(yīng)當(dāng)行產(chǎn)前檢查,并結(jié)合多項(xiàng)指標(biāo)、病史綜合考慮其原因及預(yù)后,從而做出正確判斷和準(zhǔn)確處理。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張波,何敏,楊太珠,等.超聲診斷的胎兒孤立性股骨短小的臨床分析[J].中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(12):1123-1125.

[2] Bellus GA, Ri HTDL, Hecht JT,etal. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3[J]. Am J Hum Genet, 1995,56(2):368-373.

[3] 袁靜,嚴(yán)小艷,叢林.胎兒四肢短小的產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)學(xué),2007,28(3):272-274.

[4] 徐穎,宋曉梅,張銳利,等.胎兒肢體畸形的超聲診斷與染色體異常的相關(guān)性分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(34):6715-6718.

[5] 張國(guó)正,葛群,王海濤.胎兒股骨短小的臨床診療分析(附276例病例報(bào)告)[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2008,16(12):97-98.

[6] Chaudhury K,Mukherjee K.Isolated short femur alone in the mid-trimester fetus is not associated with increased risk of aneuploidy: a clinical study in eastern India[J]. Int J Reprod Contracept Obstet Gynecol, 2016,5(4):1207-1210.

[7] Raniga S, Desai PD, Parikh H. Ultrasonographic soft markers of aneuploidy in second trimester: are we lost[J]? Medgenmed, 2006, 8(1):9.

[8] 李莉,何冰,羅琳,等.超聲診斷胎兒股骨偏短的臨床評(píng)估意義[J].西部醫(yī)學(xué),2011,23(7):1336-1338.

[9] Entezami M, Albig M, Gasiorek-Wiens A,etal. Ultrasound diagnosis of fetal anomalies[M]. Stuttgart:Georg Thieme Verlag, 2004,17-40.

[10] Ville YG, Nowakowska D. Prenatal diagnosis of fetal malformations by ultrasound[M]. Sixth edi. Hoboken:Wiley-Blackwell, 2010:819-881.

[11] Gungor F, Kayserili H, Yuksel A. Prenatal evaluation of fetuses presenting with short femurs[M]//Choy RKW, Leung TY. Prenatal Diagnosis-Morphology Scan and Invasive Methods, Rijeka:InTech,2012:5-84.

[12] Green RE, Krause J, Briggs AW,etal. A draft sequence of the neandertal genome[J]. Science, 2010,328(5979):710-722.

[13] 任遠(yuǎn),游艷琴,周紅輝,等.妊娠晚期股骨短小胎兒21例臨床分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2017,52(2):86-92.

[14] 劉靖芳,湯旭磊,成建國(guó),等.軟骨發(fā)育不全患兒1例的臨床特點(diǎn)和分子機(jī)制分析[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(9):873-876.