曾永明 陳松武 欒潔 周麗珠 蒙芳慧 羅玉芬 韋曉娟 廖仲秋

【摘 要】金花茶葉、花中的總皂甙測(cè)定方法尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。采用VM24固相萃取提取裝置具有洗脫液流速恒定可控、可批量處理，保證試驗(yàn)系統(tǒng)的密閉性等優(yōu)點(diǎn)，可保證結(jié)果的平行性和準(zhǔn)確性。用CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱、對(duì)總皂苷測(cè)定前處理過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，整套方法簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)結(jié)果離散性小，平行性得到提高。人參皂苷Re含量（mg）的回歸方程為y=8.149 9x+0.234 1，R2=0.999 1，結(jié)果表明，總皂苷（以人參皂苷Re計(jì)）在0.000 0～0.114 2 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

【關(guān)鍵詞】金花茶;總皂甙;固相萃取;紫外分光光度法

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2018）12-0073-02

金花茶[Camellia chrysanth（Hu）Tuyama]系山茶科（Theaceae）、山茶屬（Camellia）、金花茶組（set.Chrysantha）植物，是中國(guó)特產(chǎn)的傳統(tǒng)名茶，也是世界性的名貴觀賞植物。金花茶化學(xué)成份復(fù)雜，其主要活性物質(zhì)有皂甙、黃酮、茶多酚、茶多糖等，研究證實(shí)金花茶中物質(zhì)具有降低血清中膽固醇、提高機(jī)體免疫能力、抑制腫瘤生長(zhǎng)、降血脂、降血糖等多種生理功能。總皂甙是金花茶葉、花的主要活性成分之一，目前金花茶葉、花中的總皂甙測(cè)定方法尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，大多都是按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范 （2003年版）》“保健食品中總皂甙的測(cè)定”方法檢測(cè)，本文主要研究金花茶葉、花總皂甙含量的固相萃取-紫外可見(jiàn)分光光度比色法測(cè)定方法，并以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率為指標(biāo)進(jìn)行方法驗(yàn)證，取得了可靠的試驗(yàn)結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

目前金花茶葉、花中的總皂甙測(cè)定方法尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，大多都是按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）》“保健食品中總皂甙的測(cè)定”方法檢測(cè)。該方法采用人參皂苷Re為對(duì)照，用香草醛比色法測(cè)定總皂苷，其顯色體系為香草醛-冰醋酸-高氯酸。但在實(shí)際操作和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，采用該方法檢測(cè)的結(jié)果誤差較大，尤其是不同實(shí)驗(yàn)室間測(cè)定結(jié)果差異更大，不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

本實(shí)驗(yàn)采用VM24固相萃取提取裝置具有洗脫液流速恒定可控、可批量處理、保證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的密閉性等優(yōu)點(diǎn)，可保證結(jié)果的平行性和準(zhǔn)確性。用CNWBOND Alumina-N/XAD-

2 SPE Cartridge固相萃取小柱（規(guī)格0.8 g/2.7 g，6 mL）、對(duì)總皂苷測(cè)定前處理過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，整套方法簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)結(jié)果離散性小，平行性得到提高。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取5.71 mg人參皂苷Re對(duì)照品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。吸取10 mL人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.228 4 mg/mL）放蒸發(fā)皿中，水?。ǖ陀?0 ℃）揮干，準(zhǔn)確加入10 mL水溶解，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 樣品溶液制備

精密稱取適量樣品，置于50 mL離心管中，加水適量溶解，超聲30 min，放置至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，

3 500 r/min離心5 min，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 樣品溶液吸附及洗脫

取樣品溶液上清液置于收集管中（大于2 mL），放置于VM24固相萃取系統(tǒng)中，按以下步驟進(jìn)行吸附及洗脫。

（1）活化：在固相萃取柱中，以2.5 mL/min流速?zèng)_洗70%乙醇25 mL，然后以2.5 mL/min流速?zèng)_洗水25 mL。

（2）上樣：以1 mL/min流速加1 mL樣品溶液于固相萃取柱中。

（3）洗脫：以0.8 mL/min流速，依次用25 mL水，25 mL70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集70%乙醇洗脫液。

（4）揮干：將收集的洗脫液轉(zhuǎn)入50 mL的刻度試管中，在60 ℃下氮?dú)獯蹈伞?/p>

2.4 顯色與測(cè)定

在上述已揮干的洗脫液中準(zhǔn)確加入0.2 mL5%香草醛冰乙酸溶液，使殘?jiān)咳芙?，再?.8 mL高氯酸，混勻后60 ℃水浴上加熱10 min，冰浴冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后，以1 cm比色管于540 nm波長(zhǎng)處與標(biāo)準(zhǔn)管一起進(jìn)行比色測(cè)定。實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

樣品含量測(cè)定：分別取金花茶葉、花，進(jìn)行測(cè)定，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總皂苷的含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

4 結(jié)果分析及討論

線性關(guān)系考察：精密吸取前述“2.1”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.228 4 mg/mL），按“2.3”“2.4”項(xiàng)的方法進(jìn)行前處理并測(cè)定。以吸光度值為橫坐標(biāo)，以人參皂苷Re含量（mg）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，回歸方程為y=8.149 9x+0.234 1，R2=0.999 1，結(jié)果表明，總皂苷（以人參皂苷Re計(jì)）在0.000 0～0.114 2 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，圖1為線性關(guān)系圖。

加樣回收率試驗(yàn)：采用加標(biāo)回收率法，精密稱取金花茶花適量，分別按樣品量100%的比例各6份加入對(duì)照品，進(jìn)行測(cè)定，并分別計(jì)算回收率，結(jié)果加標(biāo)回收率在99.58%～100.05%，RSD0.18%，并與傳統(tǒng)方法（手填層析柱、人工進(jìn)行柱洗脫）進(jìn)行比較，表明該方法準(zhǔn)確度良好，且離散度低于傳統(tǒng)方法。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。凹脈金花茶花加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將顯色后樣品分別放置0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，測(cè)定吸光值，結(jié)果表明該顯色體系在1 h內(nèi)吸光度基本不變，1 h后吸光度有所降低，故在顯色后1 h內(nèi)測(cè)定。

6 討論

（1）《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）》中，保健食品總皂苷的測(cè)定，樣品采用過(guò)大孔吸附樹(shù)脂，再加顯色劑顯色后測(cè)定吸收值。操作過(guò)程中，在柱層析時(shí)，樹(shù)脂活化的時(shí)間長(zhǎng)短以及樣品在過(guò)柱時(shí)，洗脫速度快慢不一，使得測(cè)定的總皂苷結(jié)果誤差較大，無(wú)法確保檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。采用VM24固相萃取提取裝置具有洗脫液流速恒定可控、樹(shù)脂活化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，可大批量處理樣品，保證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的密閉性等優(yōu)點(diǎn)，可保證結(jié)果的平行性和準(zhǔn)確性。

（2）不同廠家的大孔樹(shù)脂、填料松緊和載藥量也對(duì)總皂苷測(cè)定影響較大，選擇CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)前處理過(guò)程，數(shù)據(jù)結(jié)果離散性小，平行性得到提高。

（3）本實(shí)驗(yàn)分析的金花茶有葉和花，在上柱前的樣品需經(jīng)離心，并經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，保證不阻塞固相萃取提取儀進(jìn)樣系統(tǒng)。

（4）對(duì)于總皂苷的測(cè)定實(shí)驗(yàn)，柱層析是關(guān)鍵步驟，而柱層析的關(guān)鍵在于柱子是否裝好和淋洗劑是否選擇恰當(dāng)。傳統(tǒng)手裝的柱子很難保證填料的質(zhì)量相同、松緊一致，在洗脫過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)氣泡，柱子塌陷等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致提取效果不佳，測(cè)定的數(shù)據(jù)重復(fù)性差。CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱將所需的填料質(zhì)量細(xì)化，并且采用了砂芯隔板，使填料的松緊一致，而且頂端的砂芯隔板使層析面平整，在洗脫時(shí)防止了柱子內(nèi)部質(zhì)量不均現(xiàn)象出現(xiàn)，優(yōu)化了本實(shí)驗(yàn)的前處理方案。采用SPE小柱進(jìn)行多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)重復(fù)性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方案。將CNWBOND Alumina-N/XAD-2 SPE Cartridge固相萃取小柱與VM24固相萃取儀相結(jié)合，也實(shí)現(xiàn)了多批樣品的同時(shí)測(cè)定，減輕實(shí)驗(yàn)室工作量。

參 考 文 獻(xiàn)

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