重金屬污染農(nóng)田微生物修復(fù)機(jī)理研究進(jìn)展

常海偉, 劉代歡, 賀前鋒

(湖南永清環(huán)保研究院有限責(zé)任公司,湖南 長沙 410330)

隨著工業(yè)化進(jìn)程的不斷加快，礦產(chǎn)資源的不合理開采及其冶煉排放、長期對土壤進(jìn)行污水灌溉和污泥施用、人為活動引起的大氣沉降、化肥和農(nóng)藥的施用等原因，造成了土壤重金屬污染嚴(yán)重。2014年4月17日，環(huán)境保護(hù)部和國土資源部聯(lián)合發(fā)布了調(diào)查結(jié)果——《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》。結(jié)果顯示，全國土壤環(huán)境狀況總體不容樂觀，耕地土壤環(huán)境質(zhì)量堪憂，工礦業(yè)、農(nóng)業(yè)等人為活動以及土壤環(huán)境背景值高是造成土壤污染或超標(biāo)的主要原因。西南、中南地區(qū)土壤重金屬超標(biāo)范圍較大；鎘、汞、砷、鉛4種無機(jī)污染物含量分布呈現(xiàn)從西北到東南、從東北到西南方向逐漸升高的態(tài)勢。其中耕地的土壤點(diǎn)位超標(biāo)率為19.4%，輕微、輕度、中度和重度污染點(diǎn)位比例分別為13.7%、2.8%、1.8%和1.1%，主要重金屬污染物為鎘、鎳、銅、砷、汞、鉛。這些重金屬元素進(jìn)入環(huán)境后無法進(jìn)一步降解，會影響植物的呼吸、光合作用及其他有益元素的吸收，對植物的生長造成危害，還會被其他生物體吸收富集進(jìn)入食物鏈，進(jìn)而危及人類健康。當(dāng)重金屬元素在人體富集到一定程度時便會引起多種健康問題，輕微的重金屬中毒會引起惡心、頭痛，影響胎兒的智力發(fā)育等。而重度重金屬中毒會對人體器官(如肝臟、腎臟等)造成嚴(yán)重的破壞，還可導(dǎo)致骨痛病、先天畸形，甚至引起死亡。當(dāng)土壤受到外源重金屬污染時，微生物的活性和生物量會受到一定程度的影響。為了維持自身的生存要求，土壤微生物的各種代謝活動會發(fā)生不同程度的改變。有研究表明，污染土壤的微生物代謝熵是未受重金屬污染土壤的2倍左右，重金屬的濃度高低影響了微生物的代謝活動，進(jìn)而影響了土壤的呼吸作用[1-2]。也有大量研究表明，重金屬的污染會對土壤微生物的生物量產(chǎn)生很大影響[3-5]。Kandeler等[5]研究了Pb污染礦區(qū)土壤中微生物生物量，結(jié)果表明靠近礦區(qū)土壤中微生物生物量顯著低于遠(yuǎn)離礦區(qū)土壤的微生物生物量。某些重金屬在濃度很低時也表現(xiàn)出高毒性，如Cd、Hg等。Cd離子能與含氨基、羧基，特別是巰基的蛋白質(zhì)分子相互結(jié)合，而使得微生物體內(nèi)很多功能酶的活性受到抑制甚至破壞，對細(xì)胞產(chǎn)生突變效應(yīng)，導(dǎo)致DNA堿基改變。Hg離子同樣也能導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂、突變，抑制蛋白

質(zhì)和核酸等大分子的合成，破壞蛋白的功能和結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞分裂中斷。Pb可與細(xì)胞內(nèi)各種氨基酸、蛋白質(zhì)、功能酶的功能基團(tuán)相互結(jié)合，造成細(xì)胞膜的損傷，影響營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，干擾機(jī)體細(xì)胞的生理生化功能。鑒于重金屬對環(huán)境及人類造成的潛在威脅，近些年對重金屬污染土壤的修復(fù)已經(jīng)成為人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

1 重金屬污染農(nóng)田修復(fù)的方法

重金屬污染土壤修復(fù)一般是通過物理、化學(xué)以及生物方法對重金屬進(jìn)行降解、吸收、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，使重金屬濃度與毒性風(fēng)險降低到可接受范圍，最終達(dá)到相應(yīng)土地類型的利用要求。土壤重金屬污染修復(fù)方法在治理途徑方面通常分為兩種：一種是改變土壤中重金屬的賦存形態(tài)，將其固定在土壤中，降低重金屬的遷移性與生物可利用性；另一種則是根源性地去除土壤中重金屬，保證重金屬的存留濃度不超過土壤背景標(biāo)準(zhǔn)。基于這兩種途徑，人們提出多種重金屬修復(fù)方法，如物理修復(fù)包括客土法、電動修復(fù)法、熱處理法[6-8]，化學(xué)修復(fù)包括固化/穩(wěn)定化法、淋洗法等[9-10]，常見的鈍化材料如表1所示。

表1 主要鈍化劑材料及鈍化機(jī)理[4]Table 1 The major passivator materials and the passivation mechanisms[4]

物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)在一定程度上能提高土壤pH，降低土壤中有效態(tài)鎘含量，但是這些措施都存在局限性：傳統(tǒng)的物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)去除土壤中重金屬污染物的成本相對較高，對于一些復(fù)合污染的土壤處理效果并不明顯，容易引起土壤生態(tài)環(huán)境的破壞，導(dǎo)致土壤生物活性降低，土壤養(yǎng)分不平衡而使作物減產(chǎn)。生物修復(fù)是一項新型、高效的修復(fù)技術(shù)，可以克服物理化學(xué)技術(shù)的諸多弊端，從而得到廣大專家學(xué)者的關(guān)注。利用微生物修復(fù)土壤重金屬污染，不僅低能、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，而且能改善土壤環(huán)境，提高土壤生物活性，促進(jìn)農(nóng)作物生長，達(dá)到增產(chǎn)增收效果。因此，微生物修復(fù)技術(shù)在土壤修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 重金屬污染土壤微生物修復(fù)研究進(jìn)展

微生物作為土壤中活躍的有機(jī)膠體，具有優(yōu)越的物理化學(xué)特性，如：比表面積大，具有很強(qiáng)的吸附、絡(luò)合能力，表面基團(tuán)豐富等，因此土壤微生物對土壤污染的修復(fù)有較為深刻的影響。微生物與重金屬的作用機(jī)理因其種屬及形態(tài)的差異表現(xiàn)出不同的修復(fù)機(jī)制?？傮w來說，微生物的作用機(jī)理可以分為吸附、轉(zhuǎn)化、溶解三種[11-12]，如圖1所示。

圖1 微生物與重金屬離子之間的作用機(jī)制Fig.1 Mechanism of interaction between micro-organism and heavy metal ions

2.1 生物吸附、富集

微生物對重金屬的吸附、富集表現(xiàn)為對環(huán)境中重金屬的吸附和富集作用，機(jī)理主要為胞外沉淀作用、胞外絡(luò)合作用、細(xì)胞表面吸附、胞內(nèi)積累[13]。然而微生物吸附和富集存在明顯的區(qū)別，微生物表面復(fù)雜的結(jié)構(gòu)對重金屬離子的吸附起著至關(guān)重要的作用，其細(xì)胞壁及表面黏液層可以直接吸附重金屬,是一種被動代謝過程[14]。大多數(shù)微生物表面帶有陰離子基團(tuán)(羧基、羥基、羰基、氨基、巰基、磺酸基、磷酸酯基等)而表現(xiàn)出電負(fù)性(表2)，更有利于重金屬的吸附。已有研究對微生物的吸附能力做了一些探索，如表3所示，像細(xì)菌(枯草芽胞桿菌)、真菌(根霉菌)、酵母菌(釀酒酵母)、藻類(海藻)等[15-18]。Kuroda等[19]采用細(xì)胞表面展示技術(shù)，將酵母菌金屬硫蛋白表達(dá)在酵母菌細(xì)胞表面，大大提高酵母細(xì)胞吸附重金屬的能力。Pulsawat等[20]研究發(fā)現(xiàn)，胞外聚合物EPS可快速固定Mg2+、Pb2+和Cu2+，對Pb2+具有最高的親和力。細(xì)菌較其他種類微生物表現(xiàn)出優(yōu)異的吸附性能，因?yàn)榧?xì)菌具有巨大的比表面積且細(xì)胞表面具有豐富的表面基團(tuán)。另外，現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)(如次代測序技術(shù)[21]、轉(zhuǎn)基因技術(shù)[22])的引入大大增加了微生物對重金屬的吸附容量，使得重金屬的靶向選擇吸附成為可能。

表2 吸附重金屬離子的主要功能基團(tuán)[23]Table 2 Important functional groups involved in metal ion biosorption[23]

微生物富集是細(xì)胞內(nèi)分泌的載體蛋白(金屬硫蛋白)、絡(luò)合物及多肽物質(zhì)等與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重金屬發(fā)生一系列反應(yīng)形成沉淀或絡(luò)合物而將重金屬固定、積累。它是一種主動代謝的部分可逆過程，期間需要能量和呼吸作用才能夠完成[14]。微生物富集過程發(fā)生在重金屬濃度在微生物耐受范圍內(nèi)或是對某些重金屬的解毒過程[24-25]，其能耐受一定濃度的重金屬，但如果重金屬濃度過大就會對微生物造成毒害并產(chǎn)生一定的損傷。Anushree研究發(fā)現(xiàn)，在菌體細(xì)胞內(nèi)操縱子的作用下，Cd2+與金屬硫蛋白結(jié)合成復(fù)合物或多磷酸鹽沉淀從而降低了Cd毒性。重組的大腸埃希菌能分泌表達(dá)一種Cd2+螯合多肽，大大增加了Cd在細(xì)菌胞內(nèi)的富集[26]。另外，全基因組測序技術(shù)的應(yīng)用能標(biāo)記靶向基因進(jìn)一步提高微生物對重金屬的富集效率[27-28]。

表3 微生物對不同重金屬的吸附容量(mmol/g)[29]Table 3 Metal ion biosorption capacity of micro-organism(mmol/g)[29]

2.2 生物轉(zhuǎn)化

微生物對重金屬離子的生物轉(zhuǎn)化作用主要包括氧化還原、甲基化/去甲基化和配位絡(luò)合等，通過這些作用能改變重金屬離子的溶解性、遷移性，將其轉(zhuǎn)化為低毒或無毒的物質(zhì)，降低生態(tài)危害性，減少重金屬的毒性[30]。如將Mn4+還原為Mn2+、Cr6+還原為Cr3+、Hg2+轉(zhuǎn)化為具有揮發(fā)性的Hg等。

微生物參與的氧化還原反應(yīng)可以分為同化和異化氧化還原反應(yīng)兩種形式。在同化反應(yīng)中重金屬離子以末端電子受體參與微生物代謝過程，而異化反應(yīng)中重金屬離子并未直接參與其中，間接的影響代謝反應(yīng)過程。微生物在代謝過程中產(chǎn)生的汞還原酶可催化還原離子態(tài)汞為元素態(tài)汞，形成的汞通過揮發(fā)或以沉淀的方式從土壤環(huán)境中去除，消除汞對環(huán)境的生態(tài)威脅[31]。Cr(Ⅵ)還原微生物可通過酶促反應(yīng)或以其他還原性化合物為電子供體存在下，可將有毒的Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，低毒性的Cr(Ⅲ)被微生物自身代謝產(chǎn)生的物質(zhì)絡(luò)合[32]。甲基化/去甲基化是很多重金屬生物地球化學(xué)循環(huán)過程中的重要轉(zhuǎn)化過程。對As來說，甲基化產(chǎn)物可以降低其生物毒性，許多微生物可以將無機(jī)砷轉(zhuǎn)化為甲基化合物(甲基砷酸、二甲基砷酸、三甲基砷酸氧化物)等毒性較低的物質(zhì)。有研究表明青霉菌對砷具有甲基化作用，培養(yǎng)一周后砷的揮發(fā)量高達(dá)43.94 μg[33]。而對于Hg而言，去甲基化才能降低其生物毒性。目前較為常見的一種研究是運(yùn)用mer操縱子編碼作用蛋白，通過去甲基化過程，將毒性大的有機(jī)汞轉(zhuǎn)化為零價汞。某些微生物在汞還原酶和有機(jī)汞裂解酶的作用下可將甲基汞轉(zhuǎn)化為元素態(tài)汞和甲烷，但硫酸鹽還原菌(SRB)和產(chǎn)甲烷菌則是將甲基汞轉(zhuǎn)化為汞離子和二氧化碳等物質(zhì)，其反應(yīng)方程如公式1所示[34]。微生物也可通過自身的活動引起周邊環(huán)境條件的變化(如pH)，從而改變環(huán)境介質(zhì)對重金屬的吸附特性。

2.3 生物溶解

由于微生物與重金屬作用的復(fù)雜多樣性，土壤微生物能夠利用土壤中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)生長代謝出多種小分子有機(jī)酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、檸檬酸、丁酸等，這些有機(jī)酸可與土壤重金屬化合物及含重金屬的礦物發(fā)生一系列反應(yīng)，促進(jìn)土壤中重金屬的溶解，提高其生物有效性[35]。Choppala等研究了3種真菌(Aspergillusniger、Penicilliumbilaiae和Penicilliumsp．)對重金屬污染土壤的修復(fù)能力。在不同濃度重金屬脅迫下考察其分泌的主要有機(jī)酸種類，結(jié)果表明A.niger、P.bilaiae的主要分泌物為草酸和檸檬酸，在重金屬污染土壤中重金屬被顯著活化，Pb2+、Cu2+、Zn2+的最大釋放量分別達(dá)到12%、90%、35%，Penicilliumsp．對重金屬未表現(xiàn)出顯著作用。重金屬活化的原因主要是微生物產(chǎn)生的小分子螯合酸及土壤pH的下降[36]。王桂萍等[37]從廢舊的銅礦區(qū)分離篩選出對銅具有高抗性的菌株F16a(腸桿菌屬)和F17a(假單胞菌屬)，研究兩種菌株對CuCO3的溶解作用。在含有高濃度Cu2+的液體中培養(yǎng)48 h后，接種F16a培養(yǎng)基上清液中Cu2+濃度增加了近3倍，而接種F17a的培養(yǎng)基上清液中Cu2+濃度反而下降了近6倍，這是因?yàn)镕17a菌對Cu2+具有胞內(nèi)積累作用。通過盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證F16a(腸桿菌屬)對Cu的作用效果，結(jié)果表明重金屬污染土壤接種F16a后，土壤中Cu2+活性顯著提高，同時，三葉草中Cu2+的積累量顯著增加[38]。所以，重金屬的活化程度取決于微生物有機(jī)酸產(chǎn)生量的大小，而有機(jī)酸的產(chǎn)生又由多種機(jī)制以及多個過程決定，所以微生物溶解重金屬的潛力還需要進(jìn)一步的研究。

2.4 生物表面活性劑

生物表面活性劑是由微生物或微生物-植物共生在一定條件下產(chǎn)生的具有一定表面活性的兩性(疏水性和親水性)代謝產(chǎn)物。表面活性劑分子結(jié)構(gòu)主要由疏油親水的極性基團(tuán)和疏水親油的碳?xì)滏湻菢O性基團(tuán)兩部分組成。在土壤界面，微生物產(chǎn)生的表面活性劑與重金屬形成各種配合物，把重金屬從土壤中解析出來，增加重金屬的植物可利用形態(tài)。微生物表面活性劑可能主要通過兩種形式使重金屬從土壤界面解析，一種是絡(luò)合土壤液相中的游離態(tài)重金屬離子；另一種是降低重金屬與土壤之間的界面張力，使重金屬與生物表面活性劑直接接觸捕獲[39]。如果土壤中重金屬的濃度過高超過了微生物自身生存的耐受程度，也可以單獨(dú)施用生物表面活性劑與重金屬反應(yīng)沉淀，再通過一系列的其他方式將其從土壤中分離除去。有研究表明微生物表面活性劑鼠李糖脂(銅綠假單胞菌產(chǎn)生)經(jīng)過發(fā)泡后對Pb2+和Cd2+的去除率達(dá)到68%和73%[40]。Chen等[41]研究微生物表面活性劑認(rèn)為其與重金屬離子之間的作用主要分為三步：①微生物表面活性劑的吸附過程，即微生物表面活性劑從膠束中分離并吸附在土壤顆粒表面；②競爭吸附位點(diǎn)，土壤溶液中的表面活性劑分子與被吸附的分子競爭土壤顆粒表面的吸附位點(diǎn)；③重金屬離子的去除，微生物表面活性劑形成的單分子層在土壤兩相界面會發(fā)生重排，使活性劑分子的親水基團(tuán)朝外，絡(luò)合重金屬離子后形成穩(wěn)定的可溶物以達(dá)到去除的目的。朱清清等[42]研究了皂角苷在不同濃度及pH值下對復(fù)合重金屬(Cd、Pb、Zn、Cu)污染土壤的修復(fù)效果，結(jié)果表明當(dāng)pH為5.2，皂角苷濃度為5%時土壤中Cd2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+的去除率分別為45%、19%、17%、24%。另外，生物表面活性劑的種類、濃度及環(huán)境的pH值、土壤類型都會對修復(fù)效果產(chǎn)生一定的影響[43]。

3 微生物-植物聯(lián)合修復(fù)

植物修復(fù)是土壤重金屬污染修復(fù)的一種徹底有效的方法，但是其修復(fù)效率受很多因素的影響。若污染土壤重金屬濃度過高，植物的物理化學(xué)特性及抗性機(jī)制都會受到抑制，大大降低重金屬的修復(fù)效率。為克服這一弊端，采用微生物-植物聯(lián)合修復(fù)的方法，利用微生物對重金屬的解毒作用，減少重金屬對植物的危害，促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)植物修復(fù)重金屬的能力，原理如圖2所示。

微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物(如：有機(jī)酸、載體蛋白、植物激素等)會對土壤中重金屬的活性產(chǎn)生一定的影響。重金屬污染土壤中金屬離子與土壤粒子之間緊密結(jié)合，不容易被富集植物提取吸收[44]。某些細(xì)菌能分泌一些小分子有機(jī)酸溶解被固定的重金屬如Ni[45]、Cu[46]和Zn[47]，促進(jìn)植物對其的吸收。許多有機(jī)酸像乳酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、酒石酸、甲酸、琥珀酸都具有螯合重金屬的特性[48]。Gamalero等研究表明接種微生物活性劑(PSB)能增加重金屬的生物活性，促進(jìn)重金屬從土壤中的釋放[44,49]。而植物在生長過程中分泌到根外的某些物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)等以及生長過程中死亡的根系或脫落物又能夠?yàn)槲⑸锾峁B(yǎng)分，兩者相互促進(jìn)協(xié)調(diào)生長。

圖2 微生物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬原理Fig.2 Mechanismof plant-microorganism remediation systems on heavy metal

另外，土壤中鐵離子主要以Fe3+形式存在，并能形成不溶的氫氧化物和氫氧化合物，不能被微生物及植物利用。在此條件下，細(xì)菌能產(chǎn)生一種小分子鐵載體蛋白，這種載體蛋白對Fe3+具有很強(qiáng)的親和力[50]。同樣，鐵載體蛋白對某些重金屬也具有螯合作用如Mn、Cr、Cd、Zn、Cu等[49,51]。Kumar等[52]研究表明溶磷菌屬Enterobactersp. NBRI K28能產(chǎn)生大量鐵載體蛋白，不僅能增加芥菜的生物量也能促進(jìn)芥菜對Ni+、Zn2+、Cr6+的吸收。再者，吲哚乙酸是一種非常重要的植物激素，能調(diào)節(jié)植物的形態(tài)特征及生化功能[53]。雖然吲哚乙酸能刺激根的生長并能緩解各種植物癥狀，但最主要的作用在于它能促進(jìn)植物側(cè)根的形成，增加根的表面積，擴(kuò)大植物根部與土壤粒子之間的接觸面積[54]。很多研究表明土壤中溶磷菌屬能夠分泌吲哚乙酸，它能吸附到植物根部的表面誘導(dǎo)根生成內(nèi)源吲哚乙酸，但吲哚乙酸的濃度過高也會抑制植物根部的生長發(fā)育[52]。在重金屬污染的土壤中，微生物分泌的吲哚乙酸能觸發(fā)寄主植物細(xì)胞代謝的生理變化，從而緩解高濃度重金屬污染對植物的危害。

植物在重金屬污染土壤的生長過程中往往伴生著種類繁多、功能復(fù)雜且數(shù)量龐大的耐高濃度重金屬的微生物種群，對植物的生長和土壤性質(zhì)的改變都有諸多益處。在研究植物修復(fù)相關(guān)的微生物種群中，根際微生物受到極大關(guān)注，因?yàn)樗鼈兛芍苯痈淖兺寥辣旧淼膒H也能釋放螯合劑以及發(fā)生一系列的氧化/還原反應(yīng)改變重金屬的生物活性進(jìn)而強(qiáng)化植物修復(fù)的過程。表4為國內(nèi)外微生物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬的部分研究實(shí)例。

表4 微生物溶解-植物提取/穩(wěn)定聯(lián)合修復(fù)Table 4 Micro-organismsolubilizing-phytoextraction and phytostabilization remediation

4 展 望

我國微生物資源豐富，菌種資源多樣、微生物修復(fù)產(chǎn)品種類繁多、應(yīng)用范圍廣泛。豐富的微生物資源為發(fā)展微生物修復(fù)產(chǎn)業(yè)提供了保證。總體上，微生物修復(fù)研究工作主要集中在篩選和馴化特異性高效降解菌株，提高功能菌在土壤中的活性、長期性和安全性，微生物環(huán)境參數(shù)的優(yōu)化和養(yǎng)分、溫度、濕度等關(guān)鍵因子的調(diào)控等方面。但土壤微生物修復(fù)技術(shù)在以下幾個方面還需要加強(qiáng)：首先，在開發(fā)現(xiàn)有高效微生物資源的基礎(chǔ)上，繼續(xù)篩選和馴化新的優(yōu)勢菌株，開展典型污染物微生物降解的基因組研究，以揭示其微生物遺傳多樣性與功能基因，在全面掌握污染物修復(fù)菌株生理生化特性的基礎(chǔ)上，重組構(gòu)建污染物修復(fù)關(guān)鍵酶及功能優(yōu)化的基因工程菌等；其次，由于土壤復(fù)合污染的普遍性、特殊性和復(fù)雜性，往往需要多途徑、多方式相互組合的修復(fù)手段，發(fā)展微生物修復(fù)與其他現(xiàn)場修復(fù)工程的嫁接和移植技術(shù)(植物-微生物聯(lián)合)，以達(dá)到徹底修復(fù)的目的，聯(lián)合修復(fù)手段在重金屬污染土壤的修復(fù)中顯示出很好的應(yīng)用前景；最后，實(shí)驗(yàn)室修復(fù)研究階段因研究條件較為理想化，干擾因素可控，其修復(fù)效果較為明顯，而放大到現(xiàn)場條件下，環(huán)境因素復(fù)雜，修復(fù)效果將大打折扣。因此，微生物修復(fù)技術(shù)的工程化研究必須結(jié)合環(huán)境工程、環(huán)境化學(xué)及環(huán)境土壤學(xué)等多學(xué)科知識，構(gòu)建出一套因地制宜的污染土壤田間修復(fù)工程集成技術(shù)，并設(shè)計開發(fā)出針對性強(qiáng)、高效簡潔、成本低廉的微生物修復(fù)設(shè)備，以實(shí)現(xiàn)微生物修復(fù)技術(shù)在工程化應(yīng)用上質(zhì)的飛躍。

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