基于代謝組學的功能性蛹蟲草成分研究

王升厚， 牛世莉， 徐方旭， 王 澤， 柳葉飛

(1.沈陽師范大學 實驗教學中心，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北蟲草，是蟲草屬模式種之一，在遼寧省栽培規(guī)模極大，每年生產(chǎn)干品約6 000 t，成為區(qū)域特色經(jīng)濟的典型代表[1-2]。蛹蟲草的有效成分和保健價值早已在眾多文獻中報導，但目前能夠檢測的成分種類還十分有限，主要集中在蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷、麥角甾醇、SOD酶等[3]。蛹蟲草子實體中是否含有其他生物活性成分或有價值的化學物質(zhì)，一直是蟲草行業(yè)和藥物研究人員希望解答的問題。2017年10月19日，《細胞》雜志子刊《Cell Chemical Biology》在線發(fā)表了中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所王成樹老師研究團隊的最新研究成果，揭示了蟲草素伴隨保護分子噴司他丁的生物合成途徑[4]。這一發(fā)現(xiàn)表明在蛹蟲草中的確存在著重要的天然化合物需要進一步發(fā)掘，同時也說明我們對蛹蟲草的成分認知和保健價值認識還有待提高。代謝組學是一門研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的種類、數(shù)量及其在內(nèi)外因素影響下變化規(guī)律的學科，是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學之后誕生的一門新的交叉學科，它是系統(tǒng)生物學的重要組成部分，近年來已經(jīng)迅速成為生命科學研究的熱點之一[5-7]。代謝組學通過高通量、高分辨率的分析技術(shù)，結(jié)合模式識別、專家系統(tǒng)等分析方法，從整體上探討生命活動在代謝層面的特征和規(guī)律，是目前發(fā)現(xiàn)潛在活性成分的最佳方法之一[8-10]。鑒于代謝組學技術(shù)在生物樣本成分體系分析中的優(yōu)勢，本課題組委托北京邦菲生物科技有限公司，對供試的不同類別蟲草或不同來源蛹蟲草共4個樣品進行了非靶向成分體系初步分析，重點研究了功能性蛹蟲草、野生蛹蟲草、柞蠶蛹蟲草和冬蟲夏草(Cordycepssinensis)在代謝組學層面的成分差異。功能性蛹蟲草概念是沈陽師范大學蛹蟲草研究團隊2008年提出的，它是以成分指標作為蛹蟲草質(zhì)量標準的評價體系，2016年獲得發(fā)明專利《一種功能性蛹蟲草的培育方法》授權(quán)。由于功能性蛹蟲草人工培育中需要采用特殊的菌種，獨特的培養(yǎng)基配方，以及仿野生的栽培條件，因此所培育的蛹蟲草子實體內(nèi)蟲草素含量可以達到很高水平。然而除此之外是否還含有其他有價值的代謝產(chǎn)物，特別是生物活性成分一直是關(guān)注的重點。本研究是基于上述目標實施的初步探索，以期為功能性蛹蟲草的基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 采用實驗室栽培的功能性蛹蟲草為研究對象，以柞蠶蛹蟲草、野生蛹蟲草及冬蟲夏草為對照進行代謝組學分析。供試樣品的具體信息見表1。

1.1.2 主要試劑 甲醇(Fisher Scientific，LC-MS級)。

1.1.3 主要儀器 超高效液相系統(tǒng)(ACQUITY UPLC I-Class，美國Waters公司)，質(zhì)譜儀(Waters SYNAPT G2-S)，高通量組織研磨儀(Coyote-Bio G100)。

1.1.4 分析軟件 代謝組學分析軟件ProgenesisTM QI及多元統(tǒng)計分析軟件EZ-info。

表1 供試樣品的相關(guān)信息Table 1 Relevant information of the samples

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 各樣本分別稱取200 mg，破碎后溶于900 μL 75%甲醇浸提過夜，離心，取上清-20 ℃保存，代謝組學檢測備用。取200 g功能性蛹蟲草干品送廣州分析測試中心備檢。

1.2.2 代謝組學檢測 由北京邦菲生物科技有限公司執(zhí)行。色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃，樣品溫度10 ℃，流動相A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，進樣量1 μL，體積流量0.50 mL/min，梯度洗脫 0～3 min，1%→5%B；3～12 min，5%→60%B；12～15 min，60%→99%B；15～17 min，99%B。質(zhì)譜條件：采集質(zhì)量范圍為100～1 500 Da，掃描時間為0.1 s，采集模式為ESI-ESI+MSE，Lock mass：Glu-fibrinopeptide(0.3 s掃描，間隔：15 s)，毛細管電壓：3 kV(ESI+)/ 2.5 kV(ESI-)；錐孔電壓：100 V；碰撞能量(eV)：low CE：6 / High CE：20～45；電離源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流速：60 L/h。

1.2.3 主要生物活性物質(zhì)的定量檢測 由廣州分析測試中心檢測，檢測方法執(zhí)行國標或部標。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物聚類分析

通過熱圖對各蟲草樣品間代謝物的差異情況進行分析。由圖1可以看出，冬蟲夏草和柞蠶蛹蟲草代謝產(chǎn)物的種類和表達量較為接近，其次是野生蛹蟲草與這二者接近。而功能性蛹蟲草與這三種蟲草之間差異最為顯著，表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物種類豐富度更高，表達量更高。這是因為冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和野生蛹蟲草雖然寄主互不相同，但都是以高蛋白質(zhì)、高脂肪的昆蟲幼蟲或蛹體為培養(yǎng)基質(zhì)，在生活方式上都是先行寄生，后轉(zhuǎn)為腐生，因此，在代謝產(chǎn)物種類和表達量上才會比較接近。功能性蛹蟲草由于栽培基質(zhì)主要是小麥和柞蠶蛹漿，從營養(yǎng)角度講碳源和氮源搭配合理、營養(yǎng)全面，因此其代謝產(chǎn)物種類豐富度才會更高，表達量更高，與其他三者差異更為顯著。此外后者的全程腐生方式，可能也是原因之一，因為腐生有利于培養(yǎng)基質(zhì)的充分分解和代謝產(chǎn)物的合成。

圖1 4種蟲草代謝產(chǎn)物的聚類分析Fig.1 Four Chinese caterpillar fungus metabolites of cluster analysis

頂端為代謝產(chǎn)物的聚類，橫坐標表示供試樣品編號，縱坐標表示所有檢測物質(zhì)的分子量/出峰時間；紅色代表高表達，綠色代表低表達

The top is the cluster of metabolites, the horizontal coordinates represent the sample number of the sample, and the vertical coordinate represents the molecular weight/peak time of all the detected substances; Red represents high expression and green represents low expression

2.2 供試蟲草成分種類的分析

4種供試蟲草中成分總計3 045種，不同種類蟲草在代謝產(chǎn)物成分種類上存在明顯的差異。如圖2所示，功能性蛹蟲草共檢測出產(chǎn)物成分2 213種，占成分總量的72.67%，其特有成分497種；柞蠶蛹蟲草共檢出產(chǎn)物成分1 857種，占成分總量的60.98%,特有成分279種；野生蛹蟲草共檢出產(chǎn)物成分1 428種，占成分總量的46.89%，特有成分167種；冬蟲夏草共檢出產(chǎn)物成分1 024種，占成分總量的33.62%，特有成分108種。供試4種樣品全部成分統(tǒng)計結(jié)果表明功能性蛹蟲草代謝產(chǎn)物種類最多，而且特有成分數(shù)量也最為豐富。

圖2 供試蟲草成分種類的分析Fig.2 Selected Chinese caterpillar fungus species of analysis

2.3 功能性蛹蟲草部分漢化產(chǎn)物歸類分析

目前大量代謝產(chǎn)物成分尚在解析之中，對目前已經(jīng)漢化的835種已知成分進行歸類分析(表2)，結(jié)果表明，835種成分分別隸屬于12個不同的物質(zhì)類別，其中糖苷類、皂苷類和生物堿類占比最高。

2.4 差異最顯著物質(zhì)分析

利用PLS-DA分析得到4種蟲草中VIP scores最高的15個差異代謝產(chǎn)物，見圖3、表3。實驗結(jié)果表明，在VIP scores最高的15個差異代謝產(chǎn)物對比中，野生蛹蟲草表現(xiàn)出顯著的優(yōu)越性。

2.5 功能性蛹蟲草常見有效成分含量分析

功能性蛹蟲草常見有效成分的檢測委托中國廣州分析測試中心完成。表4中數(shù)據(jù)顯示，在已經(jīng)檢測的18項成分指標中，蛹蟲草特有成分蟲草素含量為5 070 mg/kg，這個數(shù)值是目前沈陽地區(qū)普通小麥蛹蟲草含量均值的3倍。此外，麥角甾醇、SOD酶、維生素E含量分別是對照組的1.27倍、3.56倍和4.49倍。鋅和鐵兩種營養(yǎng)元素含量也分別是對照組的3.3倍和2.56倍。由于功能性蛹蟲草栽培中做了富硒處理，因此，子實體中硒含量達到了60.2mg/kg，是對照組的647倍?？拱┧幬锍煞謬娝舅∫苍诒緲悠纷詸z中獲得較高數(shù)據(jù)，其含量為60 mg/kg。本檢測對照組為普通小麥蛹蟲草(PTXMC)。

表2 功能性蛹蟲草成分歸類分析Table 2 Functional ingredients cordycepsmilitaris classified analysis

圖3 VIP scores分析Fig.3 VIP scores analysis

橫坐標是VIP值，縱坐標是代謝的mg/kg值，顏色由深綠到深紅表示各顯著代謝物的相對含量

The horizontal coordinate is the VIP value, and the ordinate is the value of mg/kg metabolism. The color is from dark green to deep red, indicating the relative content of each significant metabolite

表3 不同蟲草差異顯著化合物對比表Table 3 Different Chinese caterpillar fungus compounds significant difference contrast table

注：+的數(shù)量代表物質(zhì)的含量高低

表4 功能性蛹蟲草常見化學成分檢測結(jié)果Table 4 Functional cordycepsmilitaris common chemical composition test results

續(xù)表4

3 討 論

蟲草是我國傳統(tǒng)的中藥資源，特別是冬蟲夏草，因其應(yīng)用歷史悠久，文獻資料相對豐富。在古代醫(yī)書中對蟲草功效多這樣記載：補腎益肺、治諸虛百損、專補命門[11-12]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，蟲草主要是通過調(diào)節(jié)人體免疫體系，修復人體受損器官、組織和細胞來實現(xiàn)古人對蟲草中醫(yī)理論的實現(xiàn)途徑[13-14]。成分決定功能，含量決定功效，任何一種蟲草要想發(fā)揮保健價值，一定在其子實體內(nèi)含有賴以發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。本研究在代謝產(chǎn)物層面初步實現(xiàn)了對功能性蛹蟲草、冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和野生蛹蟲草的成分認知，從檢測數(shù)據(jù)分析看，功能性蛹蟲草共檢測出代謝產(chǎn)物成分2 213種，占成分總量的72.67%，其特有成分497種，與冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和野生蛹蟲草相比具有顯著的成分優(yōu)勢。此外，除目前已經(jīng)報導的部分成分外，還含有豐富的特殊性代謝產(chǎn)物，無論是哪種蟲草其代謝產(chǎn)物成分都十分豐富，但蛹蟲草成分豐富度更高些。然而，不同蟲草間成分的差異是否會直接導致蟲草間保健價值的不同，目前還沒有直接證據(jù)。另外，本研究主要是采用非靶向代謝組學分析方案，因此，很多成分表達量高低是相對的，如果針對某些重要產(chǎn)物感興趣，還必須開展靶向代謝組學分析進行定量分析。

相對于代謝組學成分分析數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)引用的蟲草標志性成分顯然是冰山一角，因此試圖用一兩種已知成分解釋蟲草進入人體后復雜多樣的生理反應(yīng)顯然不夠全面，這也是我們多年來一直主張采用全草入“藥”的原因所在。由于本代謝組學數(shù)據(jù)尚在整理之中，本文僅提供了部分比對數(shù)據(jù)，很多結(jié)論尚無法準確給予。希望本研究能對后續(xù)的深入研究起到鋪墊和引導作用。

參考文獻:

[1] 梁宗琦.中國真菌志第32卷[M].北京:科學出版社,2007.

[2] 錢正明,李文慶,孫敏甜,等.冬蟲夏草化學成分分析[J]. 菌物學報,2016,35(4):476-490.

[3] 王林萍,余意,馮成強,等.冬蟲夏草活性成分及藥理作用研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(7):132-136.

[4] Xia YL, Luo FF, Shang YF， et al. Fungal cordycepin biosynthesis is coupled with the production of thesafeguard molecule pentostatin[J]. Cell Chemical Bioligy, 2017, 24(12):1479-1489.

[5] Hu XD, Huang X, Wang B, et al. Progress in studies on antitumor and immunomodulatory effect of Cordyceps sinensis[J]. Drug Eval Res, 2015, 38(4): 448-452.

[6] Yang ZL, Hu QX, Li J, et al. Application progress of metabonomics in traditional Chinese medicine[J]. Henan Tradit Chin Med, 2015, 35(1): 204-206.

[7] Jia MQ, Xue Y, Wang Y, et al. Applications of chromatography-mass spectrometry in traditional Chinese medicine metabonomics[J]. J Instrum Anal, 2016, 35(2): 172-178.

[8] 鄭文,王詩盛,鐘藝,等.基于代謝組學技術(shù)的蟲草鑒別研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學,2017,34 (8):1145-1149.

[9] Guo N, Fan B, Peng J, et al. Ultra-performance LC/TOF MS analysis of fruits of Ligustrumlucidum for metabolomic research [J]. Chin J ExpTradit Med Form, 2010, 16(10): 131-133.

[10] Huo JH, Du XW, Sun GD, et al. Analysis on major chemical compounds in exocarp of Juglansmandshuricabased on UPLC-Q-TOF/MS[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2016, 47(19): 3379-3388.

[11] 孫娜,崔建美,李繼安, 等.冬蟲夏草的化學成分與藥理作用分析研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2015,17(4):65-67.

[12] 朱麗娜,薛俊杰,劉艷芳, 等.蛹蟲草子實體中N6-(羥乙基)-腺苷的分離純化及抗腫瘤作用[J].食用菌學報,2013,20(1):62-65.

[13] 王明奎,丁立生,吳鳳鍔.兩頭尖總苷的抗腫瘤活性研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學報,2008,14(3):378-382.

[14] 涂少臣, 施毅. 香加皮杠柳苷對小鼠骨髓瘤細胞增殖、凋亡及移植成瘤的影響及作用機制[J].福建醫(yī)藥雜志,2017,6(2):6.

[15] 賴筱娟,劉漢清,李俊松,等.丹酚酸藥代動力學及成分相互影響研究進展[J].中國新藥雜志 2011,20(14):1287-1920.