培養(yǎng)調(diào)控激活卡伍爾氏鏈霉菌NA4產(chǎn)frontalamides類物質(zhì)的研究

張 盈， 潘華奇， 于素亞， 胡江春*

(1.中國(guó)科學(xué)院 沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

植物真菌病害是植物病害中最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、糧食安全及生物多樣性[1]。主要糧食作物水稻、小麥、馬鈴薯、玉米等均遭受真菌病害帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失約占總產(chǎn)量的10%～15%，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元[2]。由禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌引起的小麥赤霉病可使小麥在大流行年份病穗率達(dá)到50%～100%，減產(chǎn)5%～15%[3]。面對(duì)嚴(yán)重的植物真菌病害，目前最常用的就是化學(xué)防治，但是化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大面積使用帶來(lái)了水土環(huán)境污染、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問(wèn)題。同時(shí)新發(fā)生的真菌病害和超級(jí)耐藥病菌不斷出現(xiàn)[4]。因此，研制安全和高效的新型生物殺菌劑迫在眉睫。微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物在藥物先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)及其新藥開發(fā)中起著重要作用，是農(nóng)用抗生素的主要來(lái)源之一[5-6]。特別是隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)微生物基因組中(尤其是放線菌)蘊(yùn)涵了豐富多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇。如Salinisporatropica基因組中參與形成次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因蔟有17個(gè)，約占基因組總量的9.9%[7]。著名的阿維菌素產(chǎn)生菌Streptomycesavermitilis中則有25個(gè)次級(jí)代謝基因簇，占整個(gè)基因組的6.4%[8]。然而，目前僅僅從其中分離鑒定了幾類次級(jí)代謝產(chǎn)物，大多數(shù)產(chǎn)物因其合成基因?yàn)椤半[性”并沒(méi)有被發(fā)掘，因此，基于基因組序列的genome mining技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[9]。相對(duì)于異源表達(dá)、過(guò)表達(dá)正調(diào)控基因、敲除負(fù)調(diào)控基因以及全局性啟動(dòng)子的改造等激活策略，培養(yǎng)調(diào)控不需要進(jìn)行任何遺傳操作，簡(jiǎn)單有效而被研究者廣泛使用[10]。這種OSMAC (One strain many compounds) 思想指導(dǎo)下的培養(yǎng)調(diào)控，強(qiáng)調(diào)通過(guò)改變培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件、添加生物合成前體及關(guān)鍵酶激活或抑制劑等方式，可以有效挖掘微生物菌株次級(jí)代謝潛能，提高其代謝產(chǎn)物的多樣性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)“隱性”次級(jí)代謝產(chǎn)物的激活[11]。如中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所張長(zhǎng)生等，利用培養(yǎng)調(diào)控對(duì)深海鏈霉菌SCSIO 03032的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了深入的挖掘，從7個(gè)不同培養(yǎng)基條件下共分離獲得21個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物，含15個(gè)新化合物。在改良的ISP3培養(yǎng)基中，該菌產(chǎn)生了3個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素heronamides D-F，而使用改良的A1BFe+C培養(yǎng)基時(shí)，該菌則產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特的雙吲哚螺環(huán)生物堿spiroindimicins A-D[12-14]。前期對(duì)分離自南海深海沉積物的卡伍爾氏鏈霉菌NA4基因篩選發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)生PKS、NRPS類化合物的潛力，但只分離到了PKS I型的bafilomycins B1和C1[15]。為了全面、深入認(rèn)識(shí)菌株NA4合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛能，挖掘更多抗真菌先導(dǎo)化合物，采用Illumina Hiseq2500二代高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序，并組裝獲得其基因組掃描圖，進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其除了能產(chǎn)生已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的bafilomycins，還具有產(chǎn)生lantipeptide AmfS、alkylresorcinol、valinomycin、desferrioxamine_B、frontalamides、nonactin、isorenieratene、ectoine、rabelomycin和lassopeptide SRO15-2005等多種結(jié)構(gòu)類型化合物的潛力。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，該菌株中尚未被發(fā)現(xiàn)的polycyclic tetramate macrolactam (PTM) 類化合物frontalamides[16]、valinomycin[17]和alkylresorcinol[18]具有良好的抗真菌活性。為了深入挖掘這些具有抗真菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過(guò)改變培養(yǎng)基碳氮源組分，添加氨基酸前體，添加不同金屬離子等培養(yǎng)調(diào)控的手段嘗試對(duì)這些合成抗真菌活性物質(zhì)的“隱性”基因組進(jìn)行激活，并使用活性追蹤和HPLC-DAD-MS進(jìn)行分析以期發(fā)現(xiàn)新的衍生物，為進(jìn)一步進(jìn)行目標(biāo)化合物的分離和鑒定提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 卡伍爾氏鏈霉菌NA4分離自中國(guó)南海(E 111°36.160′, N 17°59.928′)水深1 464 m的海底沉積物中。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①人工海水高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，人工海水(2.5%海鹽水)1.0 L，瓊脂20.0 g，pH 7.0～7.2；②ISP2培養(yǎng)基：酵母膏 4.0 g，麥芽汁10.0 g，葡萄糖4.0 g，蒸餾水1.0 L，瓊脂20.0 g，pH 7.0；③NM2培養(yǎng)基(Novel Medium 2)：葡萄糖1.0 g，乳糖10.0 g，甘油20.0 mL，大豆蛋白胨5.0 g，硝酸銨1.5 g，酵母粉3.0 g，1倍微量元素液(FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1.0 L) 0.2 mL，蒸餾水1.0 L，pH 6.0； ④TSBY培養(yǎng)基：胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO42.5 g，葡萄糖2.5 g, 蔗糖103.0 g，蒸餾水1.0 L, pH 7.3～7.5；⑤PDA培養(yǎng)基：新鮮去皮土豆200.0 g，切成小塊，加1.0 L自來(lái)水煮至土豆松軟，用8層紗布過(guò)濾得濾液，補(bǔ)自來(lái)水至1.0 L，加入葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，自然pH。

1.1.3 試劑與儀器 DHZ-C恒溫?fù)u床(大倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)； YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；BSA2202S電子天平(賽多利斯)；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Ultimate-3000高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex)；Waters 2695.ZQ4000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)。色譜乙腈及色譜甲醇(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)AR純。

1.2 方法

1.2.1 菌株NA4基因組DNA的提取 將菌株在TSBY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，5 000×g離心10 min，棄上清，收集菌絲體，用STE緩沖液清洗菌體2次，然后用5 mL的STE緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，37 ℃溫育45 min，每隔10 min顛倒混勻；加入蛋白酶K至終濃度為0.5 mg/mL，混勻；加入600 μL的10% SDS，混勻；50 ℃溫育2～5 h，20～30 min顛倒混勻1次；加入2 mL 5 mol/L NaCl和5 mL氯仿，室溫靜置30 min以上；4 500×g 離心10 min，取上清，加0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，用滅菌的玻璃棒攪出總DNA，用70%乙醇洗滌DNA沉淀2次，小心棄上清，揮干，將基因組DNA溶于1～2 mL TE (pH 8.0) 中，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株NA4全基因組測(cè)序 利用第二代測(cè)序技術(shù)，illumina 公司的Hiseq2500進(jìn)行NA4的基因組序列掃描?；蚪M序列測(cè)定和組裝由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.2.3 菌株NA4基因組預(yù)測(cè)的次級(jí)代謝產(chǎn)物 將NA4的基因組草圖序列提交次級(jí)代謝產(chǎn)物在線分析工具antiSMASH 3.0[19]，預(yù)測(cè)NA4次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，并進(jìn)行人工校對(duì)。

1.2.4 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì) 以NM2培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)改變培養(yǎng)基碳氮源組分，添加不同金屬離子及氨基酸前體，新設(shè)計(jì)了19種發(fā)酵培養(yǎng)基(表1)。

1.2.5 菌株NA4的發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物分析 從活化好的NA4平板上，刮取1環(huán)孢子接種于ISP2培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)，于28 ℃ 180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d制備種子液，按6%的接種量接種于上述20種發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)8 d，5 000×g離心10 min，發(fā)酵上清液用等體積的丁酮萃取，萃取3次后，將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮獲得粗提取物樣品，用無(wú)水甲醇將其配成10 mg/mL的濃度備用。采用濾紙片法，測(cè)試發(fā)酵粗提物對(duì)病原真菌黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)的抑制效果。將病原真菌接種到PDA平板的中央，待菌落生長(zhǎng)至直徑5 cm時(shí)，將浸有粗提物的濾紙片放在四周。萃取液質(zhì)量濃度為10 mg/mL，濾紙片直徑為8 mm，上樣20 μL，對(duì)照用無(wú)水甲醇。將病原真菌繼續(xù)培養(yǎng)約2 d，用游標(biāo)卡尺測(cè)抑菌圈的大小。對(duì)具有抗病原真菌活性的粗提物進(jìn)行HPLC-UV分析，判斷是否有新的次級(jí)代謝產(chǎn)物激活。HPLC-UV檢測(cè)條件：流動(dòng)相A相為100%色譜甲醇，含0.05%三氟乙酸，流動(dòng)相B為超純水，含0.05%的三氟乙酸；分析程序：0～30 min，A/B(體積比)線性梯度從10∶90到94∶6；30～42 min，A/B(體積比)線性梯度從94∶6到100∶0；42～47 min，A /B(體積比)100∶0等度；47 min后，A /B(體積比)到起始洗脫濃度10∶90。檢測(cè)波長(zhǎng)為210、238、254、280 nm。

1.2.6 HPLC-DAD-MS識(shí)別激活的次級(jí)代謝產(chǎn)物 經(jīng)過(guò)活性測(cè)試和HPLC-UV分析，對(duì)激活次級(jí)代謝產(chǎn)物的粗提物進(jìn)行HPLC-DAD-MS分析和結(jié)構(gòu)識(shí)別。檢測(cè)條件：流動(dòng)相A相為100%色譜乙腈，流動(dòng)相B為超純水，含0.05%的三氟乙酸，正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，檢測(cè)分子量200～1 600； 進(jìn)樣程序：0～20 min，A/B(體積比)線性梯度從10∶90到60∶40；20～30 min，A/B(體積比)線性梯度從60∶40到80∶20；30～40 min，A/B(體積比)線性梯度從80∶20到100：0；40～50 min，A/B(體積比)100∶0等度，50 min后，A /B(體積比)到起始濃度10∶90。流速為0.53 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為全波長(zhǎng)掃描。

2 結(jié)果與分析

`2.1 菌株NA4的基因組草圖和生物信息學(xué)分析

對(duì)菌株NA4進(jìn)行Hiseq2500測(cè)序，平均測(cè)序深度超過(guò)200×，經(jīng)組裝獲得NA4基因組草圖。估算該基因組序列大小約為8.02 Mbp，GC%為72.07%。組裝獲得59個(gè)超過(guò)1 000 bp的scaffolds，Scaffold N50 286 752 bp，總堿基大小為7 767 524 bp。antiSMASH分析顯示其蘊(yùn)含了豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，預(yù)測(cè)它們編碼合成bafilomycins、lantipeptide AmfS、alkylresorcinol、valinomycin、desferrioxamine_B、frontalamides、nonactin、isorenieratene、ectoine、rabelomycin、lassopeptide SRO15-2005及其他未知結(jié)構(gòu)類型的化合物。

2.2 發(fā)酵粗提物的抗真菌活性篩選

抗真菌活性測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)用不同碳源替代甘油后，除果糖替代甘油其相應(yīng)粗提物無(wú)抗真菌活性外，其他都具有抗真菌活性。其中蔗糖替代甘油后抗真菌活性變化不大，玉米面和玉米淀粉替代甘油后對(duì)特定真菌的抑制強(qiáng)度有所改變，而麩皮替代甘油后抗真菌活性均顯著提高，提示其次級(jí)代謝產(chǎn)物可能有較大變化(表1)。當(dāng)用不同氮源替代大豆蛋白胨后，除胰蛋白胨替代其相應(yīng)粗提物的抗特定真菌(鐮刀菌)活性增強(qiáng)外，其他均無(wú)抗真菌活性。當(dāng)添加氨基酸前體供應(yīng)后，Ala添加能增強(qiáng)其抗真菌活性，Orn添加則降低其抗真菌活性。當(dāng)添加不同濃度的金屬離子后，抗真菌活性均顯著降低。

表1 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及發(fā)酵粗提物對(duì)病原真菌的活性測(cè)試Table 1 The design of medium and the inhibitory activities against pathogenic fungi

注：表中數(shù)據(jù)代表抑菌圈直徑(mean±s.d，mm)；萃取液質(zhì)量濃度為10 mg/mL；濾紙片直徑為8 mm；上樣20 μL；“-”代表“替代”；“+”代表“添加” (如：“NM2-甘油+果糖”代表“將NM2培養(yǎng)基中的甘油用等量的果糖替代”)

2.3 抗真菌活性的發(fā)酵粗提物HPLC-UV分析

對(duì)具有抗真菌活性的粗提物，尤其是抗菌活性增強(qiáng)的粗提物，進(jìn)行HPLC-UV檢測(cè)，分析代謝產(chǎn)物的變化情況。比較使用不同碳源替代甘油培養(yǎng)NA4研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)生抗真菌活性的發(fā)酵培養(yǎng)基中，除麩皮替代甘油外均產(chǎn)生了bafilomylins,它們對(duì)特定病原菌的抗菌強(qiáng)度變化可能因?yàn)閎afilomycins各同系物相對(duì)產(chǎn)量不同引起。而麩皮替代后抗真菌活性增強(qiáng)，但bafilomycins色譜峰消失，在RT 45～50 min出現(xiàn)了一系列色譜峰，提示其已經(jīng)激活了其他類型抗真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物(圖1)。氮源替代結(jié)果顯示，胰蛋白胨替代大豆蛋白胨對(duì)特定真菌的抑制強(qiáng)度發(fā)生變化主要是因?yàn)閎afilomycins的幾種主要產(chǎn)物的相對(duì)含量變化造成(圖2)。而添加前體氨基酸引起的抗真菌活性變化主要是bafilomycins產(chǎn)量提高(添加Ala)或bafilomycins產(chǎn)量降低(添加Orn)引起。添加二價(jià)金屬離子導(dǎo)致抗真菌活性的降低也主要是bafilomycins產(chǎn)量減少的原因(圖3)。綜上，結(jié)合抗真菌活性和HPLC-UV圖譜分析結(jié)果，選擇麩皮替代甘油的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行LC-DAD-MS結(jié)構(gòu)分析和識(shí)別。

圖1 碳源替代方式下不同培養(yǎng)基中具有抗真菌活性粗提物的HPLC-UV圖譜Fig.1 The HPLC-UV fingerprint profiles of the antifungal activity of crude extracts in different media with

2.4 HPLC-DAD-MS分析和識(shí)別麩皮替代甘油后激活的抗真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物

從HPLC-DAD圖譜可以看出，麩皮替代甘油后激活產(chǎn)生了一系列紫外最大吸收波長(zhǎng)約為230 nm、320 nm的化合物(圖4)，推測(cè)它們應(yīng)為同一類型的化合物。采用正負(fù)離子掃描模式對(duì)其主要的7個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS分析，推測(cè)其分子量，結(jié)合其DAD紫外吸收特征、抗真菌活性以及生物信息學(xué)分析結(jié)果可推斷它們是PTM化合物家族中的frontalamides及其衍生物。MS數(shù)據(jù)分析顯示(表2)，化合物6對(duì)應(yīng)的分子量為508 Da，推測(cè)為frontalamide B，化合物2和5相應(yīng)分子量均為512 Da，為HSAF(heat-stable antifungal factor)的同分異構(gòu)體，化合物1和3分子量為526 Da，而目前尚未發(fā)現(xiàn)該分子量的PTM類化合物，推測(cè)它們可能為新的frontalamide A二氫還原產(chǎn)物。

圖2 氮源替代和添加氨基酸前體方式下不同培養(yǎng)基中具有抗真菌活性粗提物的HPLC-UV圖譜Fig.2 The HPLC-UV fingerprint profiles of the antifungal activity of crude extracts in different media with nitrogen source substitution and adding amino acid precursor

圖3 添加金屬離子條件下不同培養(yǎng)基中具有抗真菌活性粗提物的HPLC-UV圖譜Fig.3 The HPLC-UV fingerprint profiles of the antifungal activity of crude extracts in different media with adding metal ion

圖4 鏈霉菌NA4“NM2-甘油+麩皮”培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物的HPLC-DAD圖譜Fig.4 The HPLC-DAD fingerprint profiles of the fermentation crude growing in the NM2 medium replacing glycerol with bran

表2 基于LC-MS分析獲得的“NM2-甘油+麩皮”培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物中主要的PTMs化合物Table 2 The main PTM compounds of the fermentation crude of strain NA4 growing in the NM2 medium replacing glycerol with bran using LC-MS detection

3 討 論

卡伍爾氏鏈霉菌 NA4分離自中國(guó)南海1 464 m深的海底沉積物，是挖掘抗真菌抗生素的新資源。為了深入挖掘NA4中抗真菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，本研究采用培養(yǎng)調(diào)控的手段嘗試對(duì)上述預(yù)測(cè)化合物的合成基因簇進(jìn)行激活。研究發(fā)現(xiàn)，碳源改變對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物影響很大，甘油被果糖替代后抗真菌活性完全消失，不產(chǎn)生bafilomycins(經(jīng)HPLC-UV分析證明，數(shù)據(jù)未顯示)；甘油被麩皮替代產(chǎn)生了PTM類型的抗真菌活性物質(zhì)。甘油是三碳延伸單位的前體，它的添加有利于大環(huán)內(nèi)酯類化合物的形成[20]。據(jù)報(bào)道bafilomycins骨架合成的結(jié)構(gòu)延伸單元甲氧基丙二酰CoA是以甘油為前體合成的[21]。因此將基本培養(yǎng)基中的甘油用其他碳源替代，將不利于bafilomycins的產(chǎn)生，而有利于激活其他非PKS類型的基因簇。而其他碳源替代則引起了bafilomycins產(chǎn)量及其組成相對(duì)含量的變化。蛋白胨作為重要的氮源，其存在與否及含量的改變都對(duì)微生物初級(jí)代謝和次級(jí)代謝有很大的影響[22]。因此將基本培養(yǎng)基中的大豆蛋白胨用其他氮源替代，探索對(duì)鏈霉菌次級(jí)代謝的影響，以期激活初始條件下難以產(chǎn)生的化合物。氮源替代實(shí)驗(yàn)表明，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中大豆蛋白胨替換后，除了胰蛋白胨外，其余都不再產(chǎn)生bafilomycins，這也間接證明蛋白胨有利于微生物初次和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[25]。Orn是PTM類化合物NRPS模塊腺苷?；Y(jié)構(gòu)域識(shí)別的特異性氨基酸，Ala是valinomycin中結(jié)構(gòu)單元L-Lac的前體，也是轉(zhuǎn)氨酶常用的氨基供體。期望Orn、Ala的添加有利于PTM和valinomycin化合物合成基因簇的激活，但很遺憾沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)的產(chǎn)生。Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子是微生物代謝中許多關(guān)鍵酶的輔因子，它們參與細(xì)胞代謝并影響著細(xì)胞內(nèi)的能量供應(yīng)、還原-氧化水平等[23]。但添加不同濃度二價(jià)離子后，發(fā)現(xiàn)bafilomycins產(chǎn)量減少，抗真菌活性降低，并沒(méi)有出現(xiàn)其他抗真菌物質(zhì)。以上實(shí)驗(yàn)提示，雖然Orn、Ala和二價(jià)金屬離子對(duì)鏈霉菌NA4的次級(jí)代謝有很大影響，但要產(chǎn)生有利預(yù)期的調(diào)控，其添加的濃度和方式還需要優(yōu)化。

PTM是PKS-NRPS雜合的具有多環(huán)稠合的大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物，目前發(fā)現(xiàn)的這類化合物有40多種，包括frontalamides、alteramide A、ikarugamycin等[23]。PTM生物合成基因簇保守且廣泛存在，該家族的化合物具有多種生物活性，包括抗真菌、抗原蟲、抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗氧化等活性[24]。但是許多PTM合成基因簇往往是沉默的，因此越來(lái)越多的科學(xué)家通過(guò)激活沉默的PTM合成基因簇以挖掘更多結(jié)構(gòu)衍生物[26,30]。在PTM家族化合物中存在5/5/6或5/6/5環(huán)兩個(gè)大類，許多研究表明PTM類物質(zhì)的合成基因簇基因構(gòu)成決定了其復(fù)雜的成環(huán)機(jī)制[26,28-29]。在ikarugamycin的生物合成基因簇中FAD依賴的氧化還原酶IkaB催化形成外部5/6環(huán)，并最終在NADPH依賴的脫氫酶IkaC催化下形成ikarugamycin的內(nèi)部五元環(huán)[29](圖5)。在frontalamides、HSAF以及pactamides等具有5/5/6環(huán)的PTM合成基因簇中由脫氫酶PtmB2/FtdC和氧化還原酶PtmB1/FtdB先后催化形成外部5/5環(huán)，并在雙功能乙醇脫氫酶PtmC作用下最終形成5/5/6環(huán)結(jié)構(gòu)[30](圖5)。鏈霉菌NA4的PTM基因簇orf 3和orf 4的基因編碼蛋白分別與PtmB1和PtmB2同源，推測(cè)其應(yīng)該合成5/5/6環(huán)結(jié)構(gòu)的PTM類化合物。菌株NA4的PTM基因簇與frontalamides基因簇都有P450氧化酶(Orf6/FtdF)，具有更相似的結(jié)構(gòu)，其是否參與6元環(huán)上的氧化值得深入研究。

將NM2培養(yǎng)基中的甘油用麩皮替代后進(jìn)行的NA4發(fā)酵，激活了最大紫外吸收波長(zhǎng)約為230 nm和320 nm特征性PTM類化合物。其中化合物4和7分子量為510 Da，可能是已知PTM maltophilin、alteramide A、xanthobaccin A、lysobacteramide B和FI-2等中的1個(gè)或2個(gè)；化合物1和3分子量為526 Da，MS圖譜中具有較強(qiáng)的脫水離子峰，提示在5/5/6環(huán)中存在羥基，符合frontalamide A的結(jié)構(gòu)特征，由于化合物1和3與frontalamide與其分子量相差2，所以推測(cè)它們可能為frontalamide A 5/5/6環(huán)中雙鍵還原或者羰基還原的產(chǎn)物(圖5)；化合物2和5為HSAF的同分異構(gòu)體，目前分子量為512 Da的PTM只有1個(gè)HSAF，因此化合物2或5中至少有1個(gè)是新的PTM類化合物。若想確定化合物2或5中具體有幾種新的PTM類化合物，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

圖5 5/5/6環(huán)和5/6/5環(huán)PTM化合物生物合成基因簇Fig.5 The biosynthetic clusters of the compounds of PTM about the ring of 5/5/6 and 5/6/5

參考文獻(xiàn):

[1] Fisher MC,Henk DA,Briggs CJ,et al.Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health[J]. Nature, 2012, 484 (7393): 186-194.

[2] 李揚(yáng), 王耀雯, 王育榮, 等. 水稻稻瘟病菌研究進(jìn)展[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 41(8): 789-792.

[3] 張潔, 伊艷杰, 王金水, 等. 小麥赤霉病的防治技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊, 2014, 34(1): 24-28.

[4] Thaden JT,Lewis SS,Hazen KC, et al. Rising rates of carbapenem-resistant enterobacteriaceae in community hospitals: a mixed-methods review of epidemiology and microbiology practices in a network of community hospitals in the southeastern United States[J]. Infection Control & Hospital Epidemiology, 2014, 35(8): 978-983.

[5] 武英, 王輅. 開發(fā)微生物來(lái)源天然產(chǎn)物的新技術(shù)[J]. 國(guó)外醫(yī)藥抗生素, 2010, 31(1): 1-6.

[6] Katz L,Baltz RH. Natural product discovery: past, present, and future[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2016, 43(2): 155-176.

[7] Udaany DW,Zeigler L,Asolkar RN,et al. Genome sequencing reveals complex secondary metabolome in the marine actinomyceteSalinisporatropica[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104(25): 10376-10381.

[8] Omura S, Ikeda H, Ishikawa J, et al. Genome sequence of an industrial microorganismStreptomycesavermitilis: Deducing the ability of producing secondary metabolites[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98(21): 12215-12220.

[9] Eerikly M,Challis G. Strategies for the discovery of new natural products by genome mining[J]. Challis ChemBioChem, 2009, 10(4): 625-633.

[10] 鐘晶晶，赫衛(wèi)清. 鏈霉菌隱性次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的激活[J]. 生命的化學(xué), 2016, 36(2): 231-236.

[12] Zhang W, Liu Z, Li S, et al. Spiroindimicins A-D: new bisindole alkaloids from a deep-sea-derived actinomycete[J]. Organic Letters, 2012, 14(13): 3364-3367.

[13] Saurav K,Zhang W,Saha S, et al. In silico molecular docking, preclinical evaluation of spiroindimicins A-D, lynamicin A and D isolated from deep marine sea derivedStreptomycessp. SCSIO 03032[J]. Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences, 2014, 6(3): 187-196.

[14] Zhang W,Li S,Zhu Y, et al. Heronamides D-F, polyketide macrolactams from the deep-sea-derivedStreptomycessp. SCSIO 03032[J]. Journal of Natural Products, 2014, 77(2): 388-391.

[15] Pan HQ,Yu SY,Song CF, et al. Identification and characterization of the cntifungal substances of a novelStreptomycescavourensisNA4[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2015, 25(3): 353-357.

[16] Ramadhar TR,Beemelmanns C,Currie CR, et al. Bacterial symbionts in agricultural systems provide a strategic source for antibiotic discovery[J]. Journal of Antibiotics, 2013, 67(1): 53-58.

[17] Matter AM,Hoot SB,Anderson PD, et al. Valinomycin biosynthetic gene cluster inStreptomyces: conservation, ecology and evolution[J]. Plos One, 2009, 4(9): 761-768.

[18] Kanda N,Ishizaki N, Inoue N, et al. DB-2073, a new alkylresorcinol antibiotic. I. taxonomy，isolation and characterization[J]. Journal of Antibiotics, 1975, 28(12): 935-942.

[19] Weber T, Blin K, Duddela S, et al. AntiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene cluster[J]. Nucleic Acids Research,2015,43(W1):W237-W243.

[20] Walton LJ，Corre C，Challis GL. Mechanisms for incorporation of glycerol-derived precursors into polyketide metabolites[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2005, 33(2): 105-120.

[21] Zhang W, Fortman JL,Carlson JC, et al. Characterization of the bafilomycin biosynthetic gene cluster fromStreptomyceslohii[J]. ChemBioChem, 2013, 14(3): 301-306.

[22] 陳竹, 李萬(wàn)鈞, 儲(chǔ)炬, 等. 工業(yè)羽毛蛋白胨對(duì)紅霉素基因工程菌ZL1004發(fā)酵過(guò)程的影響[J]. 中國(guó)抗生素雜志, 2011, 36(10): 751-757.

[23] Dobson LF, O′Shea DG. Antagonistic effect of divalent cations Ca2+and Mg2+on the morphological development ofStreptomyceshygroscopicusvar.geldanus[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 81(1): 119-126.

[24] Zhang G, Zhang W, Saha S, et al. Recent advances in discovery, biosynthesis and genome mining of medicinally relevant polyayclic totramate macrolactams[J]. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2016, 16(15): 1727-1739.

[25] Jomon K,Kuroda Y,Ajisaka M, et al. A new antibiotic, ikarugamycin[J]. Journal of Antibiotics, 1972, 25: 271-280.

[26] Luo Y,Huang H,Liang J, et al. Activation and characterization of a cryptic polycyclic tetramate macrolactam biosynthetic gene cluster[J]. Nature Communications, 2013, 4(1):1-8.

[27] Blodgett JA,Oh DC, Cao S, et al. Common biosynthetic origins for polycyclic tetramate macrolactams from phylogenetically diverse bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(26): 11692-11697.

[28] Lou L,Qian G, Xie Y,et al. Biosynthesis of HSAF, a tetramic acid-containing macrolactam fromLysobacterenzymogenes[J]. Journal of the American Chemical Society, 2011, 133(4): 643-645.

[29] Zhang G，Zhang W，Zhang QZ, et al. Mechanistic insights into polycycle formation by reductive cyclization in ikarugamycin biosynthesis[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2014, 53(19): 4840-4844.

[30] Saha S,Zhang W,Zhang G et al. Activation and characterization of a cryptic gene cluster reveals a cyclization cascade for polycyclic tetramate macrolactams[J]. Chemical Science, 2017, 8(2): 1607-1612.