褚薩薩 尤 娜 張 馨 楊志國(guó) 朱 進(jìn) 汪茂榮

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬八一醫(yī)院，南京 210002)

Siglec-9是CD33相關(guān)的Siglecs，胞內(nèi)區(qū)近膜端為免疫酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosineb-ased inhibitory motifs,ITIM)，通過募集酪氨酸磷酸酯酶1(SHP-1)和SHP-2，向下游傳遞抑制性信號(hào)，在細(xì)胞活化、增殖和凋亡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[1,2]。近年研究表明給予LPS刺激后激活細(xì)胞表面的Toll樣受體4(TLR4)[3]，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量明顯增加，Siglec-9抗體通過ITIM可明顯降低促炎性細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生，同時(shí)抑炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)量明顯提高[4]。與Siglec-9同源的鼠Siglec-E，募集SHP-2和抑制TBK1的活性通過TRIF通路對(duì)細(xì)胞因子IFN-β具有抑制效應(yīng)[5]。此外，Siglec-E在大腸桿菌感染中誘導(dǎo)TLR4的內(nèi)吞作用中發(fā)揮重要作用，可引起炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IFN-β表達(dá)量的變化[6]。越來(lái)越多的研究表明Siglec-9在炎性損傷過程中發(fā)揮著重要作用。為探討Siglec-9在炎癥反應(yīng)中的作用，我們制備抗Siglec-9抗體Fab段，并初步探討抗Siglec-9抗體Fab段對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1材料 大腸桿菌克隆菌DH5-α、表達(dá)菌Escherichia coli BL21(Invitrogen，美國(guó))；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(MDBIO，中國(guó))；羊抗人Fab特異性抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))；HRP標(biāo)記的羊抗人Fab特異性抗體(Sigma，美國(guó))；商品化抗Siglec-9抗體(Abcam，美國(guó))；限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ、HindⅢ、EcoR V和XhoⅠ(Thermo，美國(guó))；DNA連接酶(TAKARA，日本)；原核表達(dá)載體pETDUET-1為本實(shí)驗(yàn)室保存；His-trap Lambda Fab 柱(GE，美國(guó))；蛋白純化儀AKTA(GE，美國(guó))；10 kD超濾離心管(Millipore，美國(guó))；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol12-myristate 13-acetate，PMA)、1%青霉素/鏈霉素(Gibco，美國(guó))；THP-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；RNA提取試劑盒(飛捷,中國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2的條件下，用含有10%FBS、1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，約2～3 d換液。將最佳生長(zhǎng)狀態(tài)的THP-1細(xì)胞以每孔3×105個(gè)鋪入24孔板中，PMA(10 ng/ml)刺激48 h后使其分化為巨噬細(xì)胞，加入LPS和不同濃度(5、1、0.5 mg/ml)的抗Siglec-9抗體Fab段。

1.2.2設(shè)計(jì)與合成引物 設(shè)計(jì)通用引物(未列出)PCR擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)，陽(yáng)性克隆送檢測(cè)序后與數(shù)據(jù)庫(kù)VBASE2比對(duì)，得到可變區(qū)和恒定區(qū)的核酸和氨基酸序列。根據(jù)可變區(qū)和恒定區(qū)的序列和重疊延伸PCR的原理設(shè)計(jì)抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)引物，輕鏈引物和重鏈引物分別如下：L-F：CATGCCATGGGCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCCC； L-R；CCCAAGCTTTTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC；H-F：CCGGATATCGCAGGTGCAG-CTGGTGCAGTCTGG；H-R：CCGCTCGAGTTAAGAA-GCGTAGTCCGGAACGTCG。

1.2.3原核表達(dá)系統(tǒng)抗Siglec-9抗體Fab段的構(gòu)建及鑒定 以前期實(shí)驗(yàn)得到的陽(yáng)性噬菌體和pComb 3Xλ為模板，通過PCR分別擴(kuò)增抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳割膠回收純化，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，以抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)[7]合成輕鏈L和重組重鏈Fd。限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ/HindⅢ和EcoR V/XhoⅠ分別37℃、2 h酶切抗體輕鏈L和重組重鏈Fd。通過DNA連接酶將抗體的輕鏈和重鏈依次連接到原核表達(dá)載體pETDUET-1，得到重組表達(dá)質(zhì)粒。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5-α得到陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切鑒定并送檢測(cè)序，檢測(cè)是否存在堿基突變及氨基酸序列的變化。

1.2.4抗Siglec-9抗體Fab段的表達(dá)和純化 將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌Escherichia coli BL21過夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆接種于含抗生素的LB培養(yǎng)液中，搖菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG分別于16℃和37℃搖床過夜誘導(dǎo)表達(dá)，12 000 r/min離心5 min后收菌，PBS重懸，超破菌液后分別取上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，觀察蛋白表達(dá)是否表達(dá)以及表達(dá)蛋白存在于胞漿或包涵體中。胞漿表達(dá)蛋白的菌液超破后得到的上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。按照儀器說(shuō)明書，通過蛋白純化系統(tǒng)和His-trap Lambda Fab 柱進(jìn)行純化[8]。收集洗脫液置于分子量10 kD的超濾離心管中，低溫4 000 r/min離心30 min，獲濃縮蛋白并用分光光度計(jì)測(cè)其濃度，-80℃保存。

1.2.5抗Siglec-9抗體Fab段的特性分析 ELISA：Siglec-9蛋白包被96孔板，4℃過夜，1%的BSA 37℃封閉2 h，PBST洗3次后加入不同濃度的抗Siglec-9抗體Fab段，37℃孵育1 h，PBST洗3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗人Fab特異性抗體，37℃孵育1 h，PBST洗3次后加入TMB顯色液，檢測(cè)在450 nm處的吸光度。商品化抗Siglec-9抗體作為陽(yáng)性對(duì)照[9]。

Western blot：將純化得到的抗Siglec-9抗體Fab段經(jīng)SDS-PAGE恒壓70～140 V電泳至溴酚藍(lán)跑出終止，將膠冰浴恒流300 mA電泳1 h轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%的BSA封閉硝酸纖維素膜2 h，羊抗人Fab特異性抗體稀釋于封閉液中孵育硝酸纖維素膜1 h，TBST洗3次后化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.6抗Siglec-9抗體Fab段對(duì)炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響 參照RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書，將收集的細(xì)胞快速提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，經(jīng)變性、退火、延伸40個(gè)循環(huán)，經(jīng)定量PCR儀擴(kuò)增，引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt的方法測(cè)定TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8 的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1原核表達(dá)抗Siglec-9抗體Fab段質(zhì)粒的成功構(gòu)建和鑒定 通過PCR擴(kuò)增得到輕鏈和重鏈的可變區(qū)大小分別為350 bp和400 bp，恒定區(qū)大小分別為300 bp和400 bp，經(jīng)重疊延伸PCR連接可變區(qū)和恒定區(qū)后得到的輕鏈L和重組重鏈Fd大小分別為750 bp和800 bp(圖1A、B)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化，限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ/HindⅢ和EcoR V/XhoⅠ分別酶切后得到的輕鏈和重鏈與原核表達(dá)載體pETDUET-1連接，至此原核表達(dá)抗Siglec-9抗體Fab段質(zhì)粒構(gòu)建成功。將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5-α后得到的陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與原序列相同，并且不存在基因突變。酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的條帶與輕鏈和重鏈大小相同(圖2)。

2.2表達(dá)和純化抗Siglec-9抗體Fab段 將抗Siglec-9抗體Fab段質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌Escherichia coli BL21，得到的陽(yáng)性克隆接種于含抗生素的LB培養(yǎng)基中，搖菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入1 mmol/L IPTG分別于16℃和37℃搖床過夜誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE證明約27 kD處表達(dá)菌條帶明顯比未表達(dá)菌亮(圖3)，表達(dá)蛋白菌液超聲破碎后證實(shí)蛋白主要表達(dá)于胞漿中(數(shù)據(jù)未顯示)。輕鏈序列經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后為λ型，故選用His-trap Lambda Fab 柱根據(jù)操作步驟進(jìn)行純化，洗脫后濃縮測(cè)得蛋白終濃度為1 mg/ml。純化產(chǎn)物通過SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證，在27 kD處可看到明顯條帶，與表達(dá)菌大小符合(圖4A、B)。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Tab.1Primersusedforquantitativereal-timePCR

Primer nameDNA sequenceIL-1Forward primerATGATGGCTTATTACAGTGGCAAReverse primerGTCGGAGATTCGTAGCTGGAIL-6Forward primerACTCACCTCTTCAGAACGAATTGReverse primerCCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGIL-8Forward primerACTGAGAGTGATTGAGAGTGGACReverse primerAACCCTCTGCACCCAGTTTTCTNF-αForward primerCCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGReverse primerGAGGACCTGGGAGTAGATGAGGADPHForward primerGGAGCGAGATCCCTCCAAAATReverse primerGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

2.3ELISA驗(yàn)證抗Siglec-9抗體Fab段 Siglec-9蛋白包被96孔板，4℃過夜，加入不同濃度的抗Siglec-9抗體Fab段，采用ELISA法檢測(cè)抗Siglec-9抗體Fab段和Siglec-9之間的結(jié)合效應(yīng)。結(jié)果顯示抗Siglec-9抗體Fab段特異性結(jié)合Siglec-9，并存在量效關(guān)系(圖5)。

圖1 PCR擴(kuò)增抗Siglec-9抗體Fab段輕鏈和重鏈Fig.1 PCR amplification of anti-Siglec-9 Fab antibody light and heavy chainsNote:A.PCR amplification of light chain：1.Variable region of light chain,2.Conserved region of light chain,3.Light chain；B.PCR amplification of heavy chain：1.Variable region of heavy chain,2.Conserved region of heavy chain,3.Heavy chain.

圖2 原核表達(dá)抗Siglec-9抗體Fab段質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of anti-Siglec-9 Fab antibody plasmids by prokaryotic expressionNote:A.The plasmid with restriction endonuclease digestion：1.the plasmid was double digested with EcoRⅤ and XhoⅠ,2.NcoⅠ and HindⅢ were used for double digesting the plasmid,M.DL 10000 Maker；B.HindⅢ and XhoⅠ were used for double digesting the plasmid.

圖3 表達(dá)抗Siglec-9抗體Fab段Fig.3 Expression of anti-Siglec-9 Fab antibodyNote:1.Without IPTG；2.Induced with IPTG overnight at 16；3.Induced with IPTG overnight at 37℃.

圖4 抗Siglec-9抗體Fab段的純化產(chǎn)物Fig.4 Purified product of anti-Siglec-9 Fab antibody

圖5 ELISA檢測(cè)抗Siglec-9抗體Fab段與Siglec-9的結(jié)合活性Fig.5 Human Siglec-9 Fab fragment antibody could specific bind Siglec-9 was evaluated by ELISANote:**.P<0.01，***.P<0.001.

2.4抗Siglec-9抗體Fab段抑制炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量 在THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與LPS組相比，LPS+Fab組TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的mRNA表達(dá)量隨著抗Siglec-9抗體Fab段濃度的增加而降低，濃度為5 mg/ml時(shí)抑制效應(yīng)最強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

圖6 抗Siglec-9抗體Fab段抑制炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量Fig.6 Human Siglec-9 Fab fragment antibody inhibited mRNA expression levels of inflammatory cytokinesNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

利用前期實(shí)驗(yàn)篩選出的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增得到抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)，在嵌合抗體技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用重疊延伸PCR技術(shù)得到輕鏈L和重組重鏈Fd，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組抗Siglec-9抗體Fab段原核表達(dá)質(zhì)粒，在Escherichia coli BL21中獲得高效表達(dá)。表達(dá)的抗體經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證主要以可溶性蛋白形式存在胞漿中，避免蛋白經(jīng)過變性和復(fù)性過程，從而保證抗體的生物活性。采用親和層析柱純化后，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示純度明顯提高， ELISA結(jié)果表明通過基因工程獲得的抗Siglec-9抗體Fab段具有抗原特異性。由于單克隆抗體大部分為鼠源性抗體，相對(duì)于人類而言具有強(qiáng)烈的免疫原性，臨床治療中容易誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)[10]，從而限制了單克隆抗體在臨床治療中的應(yīng)用?；蚬こ炭贵w是繼多克隆抗體和單克隆抗體后出現(xiàn)的第三代抗體，通過基因工程技術(shù)制備的嵌合抗體是人源抗體恒定區(qū)替換鼠源抗體恒定區(qū)，將抗體進(jìn)行人源化，在保留與抗原高親和力和高特異性的基礎(chǔ)上，大大減少了鼠源性成分在機(jī)體引起的免疫排斥反應(yīng)。另外，從雜交細(xì)胞中擴(kuò)增抗體的可變區(qū)是制備基因工程抗體的關(guān)鍵步驟[11]，由于抗體可變區(qū)具有高度變異性，故PCR引物的設(shè)計(jì)在順利擴(kuò)增抗體可變區(qū)過程中有關(guān)鍵性作用。雖然存在高度變異性，但是骨架區(qū)和恒定區(qū)相對(duì)保守，故設(shè)計(jì)的引物多為保守的信號(hào)序列，因此可以保證抗體可變區(qū)的整體性和完整性[12]。

Siglec-9是免疫球蛋白超家族的重要成員，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞[13]，通過識(shí)別含有唾液酸的配體結(jié)構(gòu)介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞及病原體間的相互作用[14,15]，同時(shí)參與調(diào)控固有免疫和適應(yīng)性免疫以及免疫耐受。本研究成功構(gòu)建了抗Siglec-9抗體Fab段原核系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒，并且穩(wěn)定表達(dá)，經(jīng)純化后得到抗Siglec-9抗體Fab段，鑒定結(jié)果表明該抗體與Siglec-9結(jié)合具有高度特異性和高親和力， Siglec-9抗體Fab段可抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量，為進(jìn)一步研究該抗體參與炎癥反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mahajan VS,Pillai S.Sialic acids and autoimmune disease[J].Immunol Rev,2016,269(1):145-161.

[2] Shlapatska LM,Mikhalap SV,Berdova AG,etal.CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A[J].J Immunol,2001,166(9):5480-5487.

[3] Kawai T,Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol,2010,11(5):373-384.

[4] Ando M,Tu W,Nishijima K,etal.Siglec-9 enhances IL-10 production in macrophages via tyrosine-based motifs[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,369(3):878-883.

[5] Boyd CR,Orr SJ,Spence S,etal.Siglec-E is up-regulated and phosphorylated following lipopolysaccharide stimulation in order to limit TLR-driven cytokine production[J].J Immunol,2009,183(12):7703-7709.

[6] Wu Y,Ren D,Chen GY.Siglec-E negatively regulates the activation of TLR4 by controlling its endocytosis[J].J Immunol,2016,197(8):3336-3347.

[7] Bryksin A,Matsumura I.Overlap extension PCR cloning[J].Methods Mol Biol,2013,1073:31-42.

[8] Wang M,Zheng W,Zhu X,etal.A human anti-Toll like receptor 4 Fab fragment inhibits lipopolysaccharide-induced pro-inflammatory cytokines production in macrophages[J].PLoS One,2016,11(1):25502-25515.

[9] 胡青青，趙肅清，賀 攀，等.抗須癬毛癬菌細(xì)胞壁蛋白的卵黃抗體制備和鑒定[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2017,33(9):1350-1354.

Hu QQ,Zhao SQ,He P,etal.Preparation and identification of specific chicken egg yolk immunoglobulins against cell wall protein of Trichophyton mentagrophytes [J].Chin J Immunol,2017,33(9):1350-1354.

[10] Yamashita J,Kobayashi I,Tatematsu K,etal.Sandwich ELISA using a mouse/human chimeric CSLEX-1 antibody[J].Clin Chem,2016,62(11):1516-1523.

[11] Gu J,Ghayur T.Generation of dual-variable-domain immunogl-obulin molecules for dual-specific targeting[J].Methods Enzymol,2012,502:25-41.

[12] 姜 晶,孫 穎,劉紅艷，等.人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因引物設(shè)計(jì)方法的改良[J].微生物學(xué)雜志,2012,32(2)：60-63.

Jiang Jin,Sun Yin,Liu Hongyan,etal.Design method amelioration of human immunoglobulin gene primer in heavy chain variable region[J].J Microbiology,2012,32(2):60-63.

[13] Jandus C,Boligan KF,Chijioke O,etal.Interactions between Siglec-7/9 receptors and ligands influence NK cell-dependent tumor immunosurveillance[J].J Clin Invest,2014,124(4):1810-1820.

[14] Schnaar RL.Glycobiology simplified:diverse roles of glycan recognition in inflammation[J].J Leukoc Biol,2016,99(6):825-838.

[15] Büll C,Heise T,Adema GJ,etal.Sialic Acid Mimetics to Target the Sialic Acid-Siglec Axis[J].Trends Biochem Sci,2016,41(6):519-531.