吳 鵬 王亞東 李茂濤 蔣懷周

(1安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合學(xué)院；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院；3安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，合肥 230012)

肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration，HLD)是一種銅代謝障礙性疾病。銅作為氧化物前體促進氧自由基和有害的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物形成，刺激肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化增殖，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致肝損傷修復(fù)時細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的合成與降解不平衡，表現(xiàn)為較早出現(xiàn)中晚期肝纖維化，且病理學(xué)改變較臨床癥狀嚴(yán)重[1-3]。

Jagged/Notch信號通路是相鄰細(xì)胞之間通訊進而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的重要通路，在決定細(xì)胞命運、影響器官形成和形態(tài)發(fā)生過程中作用重大[4-5]。目前發(fā)現(xiàn)Jagged/Notch信號通路在多種致肝纖維化疾病中被激活[6-7]，但是對于HLD引起的肝纖維化，尚未清楚。本文通過構(gòu)建銅負(fù)荷大鼠肝纖維化模型，探討Jagged/Notch信號通路相關(guān)基因在大鼠肝組織的動態(tài)表達及意義，為更好認(rèn)識HLD肝纖維化發(fā)病機制提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 動物

雄性清潔級SD大鼠36只，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，12～13周齡，(200±20)g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2013-01，動物實驗符合實驗動物福利和動物倫理學(xué)要求。

1.2 儀器及試劑

OLYMPUS全自動生化儀(OLYMPUS公司)；FJ-2003γ放射免疫計數(shù)器(華粵企業(yè)集團)；石蠟切片機(Leica公司)；熒光定量PCR儀(ABI公司)；全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司)；化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Clinx Science Instruments公司)；圖像采集系統(tǒng)(Leica公司)。ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、Hyp試劑盒(建成生物工程研究所)；Masson試劑盒(索萊寶科技有限公司)；實時熒光定量PCR試劑(Thermo Fish公司)；一抗Jagged1、Notch3、Hes1、a-SMA抗體(Abcam公司)；二抗山羊抗小鼠、山羊抗兔抗體(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；即用型SABC試劑盒(博士德公司)。

2 方法

2.1 分組及造模

36只SD大鼠隨機分為正常組(6只)和模型組(30只)，正常組普通飼料喂養(yǎng)，模型組喂飼含1.5g/kg硫酸銅的粉狀飼料和0.185%硫酸銅去離子水建立銅負(fù)荷大鼠模型[8-9]，按造模后不同時間分為8、12、16、20、24周5個亞組，每組6只。各組動物分別于以上觀察時間點結(jié)束時，觀察大鼠飲食飲水、活動度及精神狀況，稱體質(zhì)量，10%水合氯醛0.4ml/kg腹腔麻醉，心臟采血，3000r/min離心10min收集血清；取肝臟稱質(zhì)量，部分組織4%中性甲醛固定，行病理及免疫組化檢測，余組織迅速液氮凍存后，-80℃冰箱保存待測。

2.2 指標(biāo)測定

2.2.1一般情況觀察 觀察各組大鼠生存狀態(tài)、肝臟形態(tài)，計算肝臟指數(shù)。

2.2.2血清學(xué)指標(biāo)測定 采用全自動生化分析儀，按照試劑盒說明書檢測各組大鼠肝功能ALT、AST含量；放免法檢測血清肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PCⅢ含量。

2.2.3Hyp含量測定 采用比色法，按照試劑盒說明書規(guī)范操作，測定各組大鼠肝組織Hyp水平。

2.2.4病理學(xué)檢查 取各組大鼠肝葉，4%中性甲醛固定。HE染色及Masson染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織炎癥及纖維化程度。

2.2.5實時熒光定量PCR 提取各組大鼠肝組織RNA后，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成引物(表1)，依據(jù)以下步驟測定各基因mRNA的表達。1)cDNA合成：反應(yīng)體系為總RNA 8μl、10μM Oligo(dT)1μl、5×M-MLV Buffer 4.0μl、10mM dNTP 2.0μl、RNasin 1.0μl等，42℃ 60min→70℃ 5min，反應(yīng)液即為cDNA。2)SYBR Green Real-time PCR：反應(yīng)體系為cDNA2.0μl、2×SYBR Green mixture10μl、引物0.4μl、2×ROXⅡ0.4μl等，擴增40個循環(huán)后(95℃,5s；60℃,34s)，95℃,15s→60℃,60s→95℃,15s。用 RQ值(2-ΔΔCt)表示待測基因mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

2.2.6Western blot檢測 肝組織加入蛋白裂解液后取上清，使用BCA法進行總蛋白定量，10%SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉-TBST緩沖液進行膜封閉處理，一抗4℃孵育過夜(beta-actin 1∶1000，Jagged1 1∶300，Notch3 1∶400，Hes1 1∶400)，TBST洗脫3次，加入相應(yīng)的二抗(山羊抗小鼠 1∶10000，山羊抗兔 1∶5000)，孵育1h，TBST浸泡PVDF膜，搖床上洗膜后，ECL發(fā)光試劑盒檢測目的蛋白。采用Quantity one灰度分析軟件分析，計算目的蛋白灰度值/β-actin灰度值即為目的蛋白相對表達量。

2.2.7免疫組織化學(xué)染色 采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)法，經(jīng)脫蠟，高壓修復(fù)后，封閉液孵育25min，滴加一抗(a-SMA 和Hes1 均為1∶200稀釋)，PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗(1∶100)及鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，DAB顯色。陽性標(biāo)本上用PBS代替一抗作陰性對照。Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量肝組織平均積分吸光度(A)值[積分吸光/組織面積]，用以代表陽性部位蛋白表達水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察

正常組大鼠毛發(fā)光澤，活躍好動，行動敏捷，食欲良好，體重持續(xù)增加。模型組大鼠隨著時間延長，逐漸出現(xiàn)精神萎靡，毛發(fā)光澤度變差，運動緩慢，食欲減退等現(xiàn)象，從造模第16周開始出現(xiàn)體重不增加或增加緩慢，甚至負(fù)增長。肉眼觀察正常組大鼠肝臟呈紅褐色，光滑柔軟，無顆粒物；模型組大鼠肝臟顏色暗紅，質(zhì)韌，邊緣變鈍，第20周及24周大鼠肝臟表面可見粗糙不平，呈沙粒狀的顆粒物。與正常組相比，模型組從第16周開始肝臟指數(shù)增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝臟指數(shù)、肝功能及肝纖維化指標(biāo)

注：與正常組比較，*P<0.05

3.2 大鼠血清學(xué)指標(biāo)水平變化

模型組大鼠ALT、AST、HA水平自造模第8周開始升高，PCⅢ、LN自第12周開始升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3.3 各組大鼠肝組織Hyp水平變化

模型組大鼠自造模第12周起Hyp含量升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：與正常組比較，*P<0.05

圖1 各組大鼠肝組織Hyp含量

3.4 大鼠肝組織病理組織學(xué)結(jié)果

HE染色及Masson 染色結(jié)果顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞條索排列規(guī)整。模型組隨著銅負(fù)荷時間延長，肝組織炎性反應(yīng)、變性壞死、纖維組織增生呈進行性加重。造模第8周表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性、少量點灶狀壞死、炎細(xì)胞浸潤；第12周表現(xiàn)為脂肪變性、壞死加重,可見炎細(xì)胞浸潤、纖維組織開始增生；第16周表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，彌漫性脂肪變性，炎細(xì)胞浸潤加重,可見輕中度碎片樣壞死，纖維條索形成。第20周表現(xiàn)為碎片狀壞死伴少量橋接壞死，可見大量纖維條索及部分纖維間隔形成。第24周表現(xiàn)為碎片狀壞死及橋接壞死加重，大量纖維間隔形成，可見部分假小葉。見圖2、3。

圖2 各組大鼠肝組織病理組織學(xué)結(jié)果(H-E染色,×200)

圖3 各組大鼠肝組織病理組織學(xué)結(jié)果(Masson染色,×200)

3.5 大鼠TGF-β1、Notch1、Notch3、Hes1、Hes5 mRNA表達情況

模型組自第12周開始Tgf-β1、Notch3、Hes1 mRNA表達升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)分析結(jié)果顯示Notch3、Hes1mRNA與Tgf-β1mRNA表達水平呈正相關(guān)。見表3。

表3 各組大鼠肝組織Tgf-β1、Notch1、Notch3、Hes1、Hes5 mRNA表達

注：與正常組比較,*P<0.05；Notch3、Hes1 mRNA與Tgf-β1mRNA水平相關(guān)性(r=0.944，0.941，P<0.05)

3.6 大鼠肝組織Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表達情況

蛋白印跡結(jié)果顯示，模型組大鼠隨著銅負(fù)荷時間延長，肝組織Jagged1、Notch3、Hes1蛋白表達量逐漸增加,至24周假小葉形成達到高峰。Jagged1自造模第12周、Notch3自造模第16周、Hes1自造模第8周開始蛋白表達量增加，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：1，正常組；2，造模第8周；3，造模第12周；4，造模第16周；5，造模第20周；6，造模第24周

與正常組比較,*P<0.05

3.7 各組大鼠肝組織Hes1、α-SMA蛋白表達情況

正常組Hes1蛋白較少表達于膽管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色，細(xì)胞核不著色；模型組隨著造模時間延長，Hes1蛋白表達逐漸增加，在假小葉形成的第24周達到高峰，主要集中于肝纖維化區(qū)域，匯管區(qū)和靠近肝纖維化區(qū)域的肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞亦有表達。肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA在正常組大鼠的肝組織未見明顯表達；模型組從第16周纖維條索形成開始表達顯著增加，第24周達到頂點，集中于匯管區(qū)的纖維間隔或纖維條索。Hes1與α-SMA表達區(qū)域大部分重合于纖維化區(qū)域。見圖5、圖6。

注：長箭頭:肌成纖維細(xì)胞

注：短箭頭：肌成纖維細(xì)胞

圖6 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達情況(SABC法，×400)

蛋白平均吸光度(A)值結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織Hes1、α-SMA蛋白表達逐漸增加，纖維條索開始形成的第16周以后增加，到假小葉形成的第24周兩者均達到高峰。相關(guān)分析顯示Hes1與α-SMA蛋白表達量呈同步正相關(guān)(r=0.952，P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝組織Hes1、α-SMA 蛋白平均吸光度(A)值比較

注：與正常組比較,*P<0.05

4 討論

Jagged/Notch信號通路進化上高度保守，通過相鄰細(xì)胞之間的相互作用決定細(xì)胞分化、凋亡、增殖。國內(nèi)外對Jagged/Notch信號通路與疾病研究以往主要集中在腫瘤、遺傳性疾病等，近期發(fā)現(xiàn)該通路與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。在新鮮分離的原代HSC細(xì)胞中可檢測到Notch配體(Jagged1)及受體(Notch1、2、4)的基因表達，致肝纖維化關(guān)鍵因子TGF-β1刺激活化HSC細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后，Notch1、Notch3 mRNA及蛋白表達呈上升趨勢，a-SMA和I型膠原表達增加[11-12]。在四氯化碳誘發(fā)肝纖維化模型，配體Jagged1，受體Notch2、Notch3 和下游分子Hes1 的mRNA表達增加，Notch信號活化形式NICD和Hes1在損傷的匯管區(qū)大量表達，應(yīng)用Notch3特異性的siRNA抑制Notch3的表達可使肌成纖維細(xì)胞分泌功能明顯降低[13]。目前對于HLD銅沉積引起的肝纖維化，尚無Jagged/Notch信號通路的相關(guān)研究。

肝臟是HLD銅蓄積主要靶器官，銅作為一種強氧化劑，長期過載可引起彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性、活動性肝炎，刺激肝星狀細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，后者大量分泌膠原纖維、層黏蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，導(dǎo)致肝損傷修復(fù)時ECM合成與降解不平衡，引起肝纖維化。

本文采用含1.5g/kg硫酸銅的粉狀飼料和0.185%硫酸銅去離子水喂飼大鼠，發(fā)現(xiàn)隨著銅在肝臟的蓄積，血清肝功能及肝纖維化指標(biāo)、肝組織Hyp含量均呈動態(tài)增高趨勢，病理學(xué)檢查展現(xiàn)了從彌漫性脂肪變性、活動性肝炎到肝纖維化形成的完整過程，為研究HLD肝纖維化提供了一個參考模型。在此過程中，Jagged1/Notch3/Hes1信號通路持續(xù)被激活，下游靶基因Hes1在纖維化區(qū)域大量表達，與肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白a-SMA表達區(qū)域大部分重合，并隨著肝纖維化的進行性加重而同步表達增加。由此我們認(rèn)為銅沉積可以激活Jagged1/Notch3/Hes1信號通路，介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并促其活化增殖，促使了肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

通過本文結(jié)果，我們推斷Jagged/Notch信號通路可能與HLD肝纖維化密切相關(guān)，開展相關(guān)研究，可以更好地認(rèn)識HLD肝纖維化的發(fā)病機制，為尋找抗HLD肝纖維化的可能作用靶點提供重要線索。目前，銅沉積通過相鄰細(xì)胞之間Jagged1/Notch3/Hes1信號通路，刺激肌成纖維細(xì)胞活化增殖的作用機制尚未清楚，我們將進一步深入研究。

[1] Carlson MD，Al-Mateen M，Brewer GJ. Atypical childhood Wilson's disease[J]. Pediatr Neurol，2004，30(1)： 57-60.

[2] Cheng N，Wang K，Hu W，et al. Wilson disease in the South chinese han population[J]. Can J Neurol Sci，2014，41(3)： 363-367.

[3] 張東鋒，王煜姝，滕軍放. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對肝豆?fàn)詈俗冃院喜⒏卫w維化肝功能的臨床研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2016，32(2)： 193-196,200.

[4] Shaya O，Binshtok U，Hersch M，et al. Cell-Cell Contact Area Affects Notch Signaling and Notch-Dependent Patterning[J]. Dev Cell，2017，40(5)： 505-511.e6. DOI：10.1016/j.devcel.2017.02.009.

[5] Wilson A，Radtke F. Multiple functions of Notch signaling in self-renewing organs and cancer[J]. FEBS Lett，2006，580(12)： 2860-2868. DOI：10.1016/j.febslet.2006.03.024.

[6] Hong Y，Yao Q，Zheng L. Thymosin β4 attenuates liver fibrosis via suppressing Notch signaling[J]. Biochem Biophys Res Commun，2017，493(4)： 1396-1401. DOI：10.1016/j.bbrc.2017.09.156.

[7] Liu Y，Huang G，Mo B，et al. Artesunate ameliorates lung fibrosis via inhibiting the Notch signaling pathway[J]. Exp Ther Med，2017，14(1)： 561-566. DOI：10.3892/etm.2017.4573.

[8] 沈斌，鮑遠程，蔣懷周，等. 肝豆靈對Wilson病模型大鼠肝組織miRNA-122表達的影響[J]. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014(6)： 50-53.

[9] 李毓雯，萬小華，寧琴，等. 銅過量負(fù)荷導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡及其對Bax Bcl-2基因表達的影響[J]. 中國當(dāng)代兒科雜志，2008，10(1)： 42-46.

[10] Ni MM，Wang YR，Wu WW，et al. Novel Insights on Notch signaling pathways in liver fibrosis[J]. Eur J Pharmacol，2018，826： 66-74. DOI：10.1016/j.ejphar.2018.02.051.

[11] 黃穎而，許嘉彬，安海燕. Notch信號通路對肝纖維化EMT環(huán)節(jié)的影響[J]. 世界華人消化雜志，2014，22(30)： 4588-4592.

[12] Chen Y，Zheng S，Qi D，et al. Inhibition of Notch signaling by a γ-secretase inhibitor attenuates hepatic fibrosis in rats[J]. PLoS One，2012，7(10)： e46512. DOI：10.1371/journal.pone.0046512.

[13] Wang Y，Shen RW，Han B，et al. Notch signaling mediated by TGF-β/Smad pathway in concanavalin A-induced liver fibrosis in rats[J]. World J Gastroenterol，2017，23(13)： 2330-2336. DOI：10.3748/wjg.v23.i13.2330.