宋啟東 涂宗財(cái),2 王 輝 楊文華 劉光憲 陸建偉

(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022)

食物過(guò)敏是指機(jī)體攝入食物或食品添加劑而引起的消化系統(tǒng)內(nèi)或全身性免疫反應(yīng)，常見(jiàn)的過(guò)敏癥狀有胃腸道紊亂、蕁麻疹和哮喘等[1]。近年來(lái)，食物過(guò)敏發(fā)生率不斷增加，有近5%的成年人和8%的兒童對(duì)食物過(guò)敏[2]。因此，降低食物過(guò)敏發(fā)生率是目前亟待解決的問(wèn)題。眾所周知，雞蛋是人類(lèi)最主要的食物資源之一，由于其具有優(yōu)良的加工特性，因此廣泛應(yīng)用于加工食品中。但它也是引起食物過(guò)敏的主要過(guò)敏源，且過(guò)敏原主要存在于蛋清中[3]。因此，研究蛋清中的過(guò)敏蛋白對(duì)于降低雞蛋過(guò)敏發(fā)生率具有重要意義。目前，對(duì)雞蛋蛋白致敏性的研究主要是采用單一方法降低雞蛋中某種特定過(guò)敏蛋白，如Mine等[4]報(bào)道通過(guò)羧甲基化可以降低卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵類(lèi)黏蛋白的致敏性；Shin等[5]報(bào)道熱處理可以降低卵清蛋白致敏性但增加了卵類(lèi)黏蛋白致敏性；Seo等[6]報(bào)道10 kGy劑量的伽馬射線輻照可以部分降低卵清蛋白致敏性。而關(guān)于采用復(fù)合改性方法降低雞蛋蛋白體系的研究還很少。

復(fù)合改性具有高效、協(xié)同等優(yōu)點(diǎn)，既可以互補(bǔ)單一方法的不足，又可以更快速、全面地改性樣品。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲能夠促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)[7]，Ma等[8]通過(guò)外接葡萄糖的糖基化使卵清蛋白致敏性顯著降低，Guan等[9]發(fā)現(xiàn)超聲波對(duì)糖基化有積極的促進(jìn)作用。由于食品是一個(gè)復(fù)雜的體系，有必要研究食品加工方式對(duì)復(fù)雜體系過(guò)敏蛋白(如市售蛋清粉)致敏性的影響。因此，本試驗(yàn)擬采用超聲預(yù)處理結(jié)合糖基化復(fù)合改性市售蛋清粉，通過(guò)間接ELISA法，以人血清IgE結(jié)合力為指標(biāo)評(píng)價(jià)蛋清粉中蛋清蛋白的致敏性，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，以兔血清IgG結(jié)合力為指標(biāo)評(píng)價(jià)蛋清粉中卵清蛋白的致敏性，利用紫外光譜、熒光光譜和電泳分析其結(jié)構(gòu)及分子量變化，研究超聲波協(xié)同糖基化修飾對(duì)蛋清粉結(jié)構(gòu)和致敏性的影響，為脫敏蛋制品的研發(fā)提供更具實(shí)際參考價(jià)值的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蛋清粉：鄭州奧冉化工有限公司；

卵清蛋白、羊抗兔酶標(biāo)二抗、羊抗人酶標(biāo)二抗：美國(guó)Sigma公司；

兔血清：自制；

人血清：美國(guó)PlasmaLab International公司；

其他試劑均為常用分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電泳儀：Mini protean Tetra MP4型，美國(guó)BIO-RAD公司；

酶標(biāo)儀：SynergyH1型，美國(guó)Bio Tek公司；

熒光光譜儀：F-7000型，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將蛋清粉用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)稀釋到10 mg/mL，離心后取上清液，再分別進(jìn)行以下處理：

(1) 熱處理：凍干處理后在70 ℃、相對(duì)濕度75%的條件下反應(yīng)6 h。

(2) 糖基化：按糖∶蛋白質(zhì)量比2∶1向溶液中加入葡萄糖，冷凍干燥后于70 ℃、75%相對(duì)濕度下反應(yīng)6 h。

(3) 不同強(qiáng)度超聲預(yù)處理結(jié)合糖基化：分別在120，360，600，840，1 080 W下超聲15 min和在600 W下超聲5，10，15，20，25 min，整個(gè)超聲過(guò)程通過(guò)冰浴將溶液溫度控制在20 ℃ 以下。然后按糖∶蛋白質(zhì)量比2∶1加入葡萄糖，冷凍干燥后于70 ℃、75%相對(duì)濕度下反應(yīng)6 h。

1.2.2 分子量測(cè)定 將樣品用PBS稀釋至10 mg/mL，加上樣緩沖液后煮沸10 min，再離心20 s，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠，樣品上樣量10 μL，80 V跑膠，結(jié)束后染色1 h，再用脫色液脫去底色。

1.2.3 內(nèi)源性熒光測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，將樣品用PBS稀釋成0.1 mg/mL，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，在300～450 nm對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.4 表面疏水性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，以ANS為熒光探針，將樣品用PBS稀釋成一系列濃度梯度(0.25～2.00 mg/mL)，取2 mL樣品與10 μL ANS試劑混勻，在激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)400～600 nm的條件下進(jìn)行測(cè)定。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，斜率為表面疏水性(H0)。

1.2.5 自由氨基含量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[12]，將樣品用PBS稀釋成40 mg/mL，分別取10 μL樣品和不同濃度(0.0～0.4 mg/mL)賴(lài)氨酸與200 μL OPA試劑混勻，避光反應(yīng)2 min，于340 nm處測(cè)定其吸光值，根據(jù)賴(lài)氨酸標(biāo)曲計(jì)算樣品自由氨基含量。

1.2.6 卵清蛋白致敏性測(cè)定 以兔血清IgG結(jié)合力為指標(biāo)，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定樣品中的卵清蛋白致敏性。每孔加入100 μL 2 μg/mL卵清蛋白標(biāo)品，4 ℃包被過(guò)夜，洗板，拍干；加250 μL 5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，洗板，拍干；分別加50 μL卵清蛋白標(biāo)品(0.25～64.00 μg/mL)和50 μL 40 μg/mL 樣品，再加50 μL兔抗卵清蛋白血清，37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL二抗37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL顯色液37 ℃反應(yīng)15 min；加100 μL H2SO4終止反應(yīng)，450 nm測(cè)吸光值。以卵清蛋白標(biāo)品的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，通過(guò)線性函數(shù)得到樣品致敏性，進(jìn)而計(jì)算其降低率。

(1)

式中：

c——卵清蛋白致敏性降低率，%；

C0——未處理原樣的致敏性，μg/mL；

C1——處理后樣品的致敏性，μg/mL。

1.2.7 蛋清蛋白致敏性測(cè)定

(1) 血清庫(kù)：1支對(duì)雞蛋不過(guò)敏的血清以及4支對(duì)雞蛋過(guò)敏的血清，4個(gè)患者(P1、P2、P3、P4)的病史見(jiàn)表1。

(2) 每孔加入100 μL 100 μg/mL的樣品，4 ℃包被過(guò)夜，洗板，拍干；加250 μL 5%脫脂奶粉進(jìn)行37 ℃封閉1 h，洗板，拍干；加100 μL人血清37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL二抗37 ℃溫育1 h，洗板，拍干；加100 μL顯色液37 ℃ 反應(yīng)15 min；加100 μL H2SO4終止反應(yīng)，450 nm測(cè)吸光值。按式(2)計(jì)算IgE結(jié)合力。

表1 雞蛋過(guò)敏患者病史Table 1 Clinical history of egg allergy patients' sera

A=A1-A0，

(2)

式中：

A——IgE結(jié)合能力；

A0——一抗為未對(duì)雞蛋過(guò)敏的人血清所測(cè)得的吸光度；

A1——一抗為患者血清所測(cè)得吸光度。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 Origin 9.0作圖，SPSS 17.0分析顯著性(P<0.05)，平行試驗(yàn)至少3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子量分析

如圖1所示，經(jīng)熱處理、糖基化和復(fù)合處理后只有卵轉(zhuǎn)鐵蛋白條帶幾乎完全消失，說(shuō)明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白不穩(wěn)定，易發(fā)生聚集。經(jīng)糖基化和復(fù)合處理后卵清蛋白、卵類(lèi)黏蛋白和溶菌酶的條帶變淺且發(fā)生了輕微的上移，說(shuō)明這3種蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)，并且復(fù)合處理后上移程度更大，說(shuō)明超聲預(yù)處理可以顯著促進(jìn)糖基化反應(yīng)，該結(jié)果和Guan等[9]的一致。同時(shí)，不同功率超聲波-糖基化處理后，其蛋白質(zhì)條帶的上移程度明顯不同，呈先增加后降低的趨勢(shì)，且在600 W時(shí)上移程度最大，說(shuō)明相比于超聲時(shí)間，功率對(duì)糖基化影響程度更大，并且適度的超聲功率才能更好地促進(jìn)糖基化反應(yīng)。這可能是超聲功率的增加影響了蛋白更深層的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)更多的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，使空間位阻更大程度地降低并暴露出更多的糖基化結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)糖基化反應(yīng)，但過(guò)度超聲也會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)重新折疊[13]進(jìn)而阻礙糖基化反應(yīng)。

U0為未處理原樣；C1為單獨(dú)熱處理；C2為單獨(dú)糖基化處理；5，10，15，20，25，120，360，600，840，1 080分別代表600 W下超聲5，10，15，20，25 min和120，360，600，840，1 080 W下超聲15 min預(yù)處理后再進(jìn)行糖基化的復(fù)合處理

圖1 超聲協(xié)同糖基化對(duì)蛋清蛋白分子量的影響

Figure 1 Ultrasound synergistic glycosylation on the molecular weight of egg white protein

2.2 內(nèi)源性熒光分析

蛋白的內(nèi)源熒光取決于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的極性以及蛋白質(zhì)間、蛋白-配體間的相互作用[14]。如圖2所示，復(fù)合處理后樣品內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨超聲強(qiáng)度(時(shí)間和功率)的增加呈先降低后升高的趨勢(shì)，在15 min、600 W時(shí)最低，且均低于單獨(dú)糖基化的樣品。這可能是超聲產(chǎn)生的機(jī)械、空化等效應(yīng)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展，暴露更多的發(fā)色團(tuán)發(fā)生熒光猝滅。并且糖基化可以使色氨酸環(huán)位置變化、蛋白結(jié)構(gòu)改變、色氨酸等殘基本身發(fā)生氧化，這些都會(huì)降低熒光強(qiáng)度[15]。過(guò)高強(qiáng)度超聲后復(fù)合處理的樣品熒光強(qiáng)度略微升高，可能是高功率或長(zhǎng)時(shí)間的超聲會(huì)使蛋白部分結(jié)構(gòu)重新折疊，將部分暴露的發(fā)色團(tuán)重新包埋。相比于熱處理，經(jīng)復(fù)合或糖基化處理后樣品的內(nèi)源熒光變化程度更小，說(shuō)明糖基化可以一定程度穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)避免熱處理對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的過(guò)度破壞[16]。

圖2 超聲協(xié)同糖基化對(duì)蛋清蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

Figure 2 Ultrasound synergistic glycosylation on the intrinsic fluorescence intensity of egg white protein

2.3 表面疏水性分析

表面疏水性(H0)是蛋白分子表面疏水基團(tuán)與極性水分子環(huán)境接觸數(shù)量的指標(biāo)，可反映蛋白的結(jié)構(gòu)變化。如圖3所示，復(fù)合處理后H0隨超聲強(qiáng)度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)(15 min、600 W達(dá)到最大)，且均高于未處理原樣，而單獨(dú)糖基化后樣品的H0顯著降低。這可能是糖基化可以通過(guò)外接親水性基團(tuán)提高親水性并將更多的疏水基團(tuán)包埋進(jìn)內(nèi)部，并且糖基化后樣品內(nèi)源熒光圖譜發(fā)生輕微的紅移，說(shuō)明糖基化通過(guò)改變蛋白結(jié)構(gòu)增強(qiáng)其極性，使H0顯著降低。而復(fù)合處理過(guò)程中，盡管促進(jìn)糖基化會(huì)降低疏水性，但超聲誘導(dǎo)空化作用使蛋白的球形結(jié)構(gòu)變?yōu)榫W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大量暴露內(nèi)部疏水基團(tuán)，還能通過(guò)破壞蛋白的疏水性相互作用誘導(dǎo)變性，最終顯著增加疏水性[17-18]。在15 min、600 W時(shí)H0最大也說(shuō)明該條件下蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)程度最大，進(jìn)一步增加超聲強(qiáng)度會(huì)使展開(kāi)的蛋白重新折疊，將部分疏水基團(tuán)重新包埋進(jìn)內(nèi)部。

U0為未處理原樣；C1為單獨(dú)熱處理；C2為單獨(dú)糖基化處理；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖3 超聲協(xié)同糖基化對(duì)蛋清蛋白表面疏水性的影響

Figure 3 Ultrasound synergistic glycosylation on the surface hydrophobicity of egg white protein

2.4 自由氨基含量分析

自由氨基含量可以反映糖基化程度。如圖4所示，復(fù)合改性后樣品自由氨基含量隨超聲強(qiáng)度的增加呈先降低后升高的趨勢(shì)(15 min、600 W達(dá)到最大)，且均低于糖基化后的樣品。說(shuō)明隨著超聲強(qiáng)度的增加，蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開(kāi)，可以有效促進(jìn)糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，在超聲強(qiáng)度超過(guò)15 min或600 W 時(shí)，蛋白分子重新折疊、聚集使空間位阻增加阻礙了糖基化反應(yīng)進(jìn)行。

2.5 卵清蛋白致敏性分析

卵清蛋白是蛋清蛋白最主要的過(guò)敏原[19]。如圖5所示，復(fù)合處理后蛋清粉中卵清蛋白致敏性降低率隨超聲強(qiáng)度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)(15 min、600 W達(dá)到最大)，且均高于單獨(dú)糖基化的樣品。這是因?yàn)閺?fù)合處理過(guò)程中，超聲可以展開(kāi)蛋白結(jié)構(gòu)修飾構(gòu)象表位、促進(jìn)糖基化反應(yīng)，而糖基化也能通過(guò)改變蛋白結(jié)構(gòu)修飾構(gòu)象表位，還能通過(guò)外接糖分子阻塞線性表位[20]，最終使過(guò)敏表位得到更全面的修飾。并且其致敏性變化與蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)變化明顯一致，說(shuō)明卵清蛋白對(duì)蛋清蛋白結(jié)構(gòu)影響顯著。對(duì)比實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，相同條件下高純度卵清蛋白致敏性與雜蛋白(蛋清粉)中卵清蛋白致敏性的變化趨勢(shì)基本一致，但蛋清粉中卵清蛋白的致敏性降低效果較差，可能是雜蛋白中不同抗原間普遍存在交叉反應(yīng)[21]，這會(huì)增強(qiáng)抗體的反應(yīng)性，而且作為未處理原樣的市售蛋清粉的部分構(gòu)象表位可能已經(jīng)在傳統(tǒng)加工中得到修飾。

U0為未處理原樣；C1為單獨(dú)熱處理；C2為單獨(dú)糖基化處理；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖4 超聲協(xié)同糖基化對(duì)蛋清蛋白自由氨基的影響

Figure 4 Ultrasound synergistic glycosylation on the free aminos of egg white protein

C1為單獨(dú)熱處理；C2為單獨(dú)糖基化處理；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖5 超聲協(xié)同糖基化對(duì)蛋清蛋白中卵清蛋白致敏性的影響

Figure 5 Ultrasound synergistic glycosylation on the antigenicity of allergenicity from egg white protein

2.6 蛋清蛋白致敏性分析

不同患者的IgE結(jié)合能力不同[22]。如圖6所示，經(jīng)復(fù)合改性后樣品的IgE結(jié)合能力隨超聲強(qiáng)度的增加呈先降低后增加的趨勢(shì)，并在15 min、600 W時(shí)最低。這是因?yàn)槌曈行Т龠M(jìn)了糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白結(jié)構(gòu)改變使更多的構(gòu)象表位被修飾，并且通過(guò)接入糖分子也使大量線性表位被阻塞，致敏性顯著降低。而過(guò)低或過(guò)高超聲強(qiáng)度的IgE結(jié)合能力會(huì)高于單獨(dú)糖基化，說(shuō)明超聲在展開(kāi)蛋白結(jié)構(gòu)促進(jìn)糖基化反應(yīng)的同時(shí)也暴露了更多的過(guò)敏表位，使致敏性增強(qiáng)，但仍低于未處理原樣。通過(guò)與卵清蛋白致敏性的對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，二者的總體趨勢(shì)是一致的，可能是卵清蛋白是蛋清蛋白最主要的過(guò)敏原，可以很好地反映蛋清蛋白的變化。但蛋清粉中不致敏的蛋白也會(huì)結(jié)合葡萄糖甚至阻礙糖與致敏蛋白接觸，降低糖基化對(duì)致敏蛋白的修飾效果，同時(shí)包含多種抗原的雜蛋白存在著更復(fù)雜的交叉反應(yīng)，在某抗原表位被修飾的過(guò)程中可能產(chǎn)生某些可被其他抗體識(shí)別的過(guò)敏表位，并且卵清蛋白含有20個(gè)糖基化位點(diǎn)，是糖基化效果最顯著的蛋白[23]，所以與卵清蛋白相比，蛋清蛋白經(jīng)復(fù)合處理后致敏性降低程度較低，但效果仍顯著。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖6 超聲協(xié)同糖基化修飾對(duì)蛋清蛋白致敏性的影響

Figure 6 Ultrasound synergistic glycosylation on the allergenicity of egg white protein

3 結(jié)論

復(fù)合處理會(huì)改變蛋清蛋白結(jié)構(gòu)從而使蛋白的致敏性發(fā)生變化，隨著超聲強(qiáng)度的增加蛋清粉中蛋清蛋白致敏性顯著降低，致敏性隨超聲強(qiáng)度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，且在15 min、600 W的條件下有最大程度降低。同時(shí)，蛋清蛋白中的卵清蛋白致敏性也與蛋清蛋白結(jié)構(gòu)變化相符，在15 min、600 W時(shí)有最大程度降低且降低程度比蛋清蛋白更顯著。說(shuō)明研究卵清蛋白致敏性也可以一定程度地反映蛋清蛋白的致敏性變化趨勢(shì)。也說(shuō)明超聲波協(xié)同糖基化修飾是一種良好的降低蛋清粉致敏性的方法，可為脫敏蛋制品的開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。