李 佳 劉忠義 陳 虞 羅鑫坪 楊 慧 李 平

(1. 廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室﹝欽州學(xué)院﹞，廣西 欽州 535000； 2. 湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105)

發(fā)酵香腸歷史悠久，2 000多年前地中海地區(qū)的古羅馬人便用碎肉加鹽、糖、香辛料等經(jīng)過(guò)自然發(fā)酵、風(fēng)干成滋香味美的香腸[1-2]，如今，發(fā)酵香腸已發(fā)展成為發(fā)酵肉制品中產(chǎn)量最大的一類產(chǎn)品。在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌發(fā)酵使可發(fā)酵性糖形成乳酸，降低產(chǎn)品的pH值。較低的pH值使得肉中的鹽溶性蛋白質(zhì)變性，形成具有切片性的凝膠結(jié)構(gòu)。添加食鹽和干燥過(guò)程可以降低肉制品的水分活度，益生菌發(fā)酵產(chǎn)生的厭氧環(huán)境，與低pH值共同作用，保證了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性[3]。

現(xiàn)代發(fā)酵香腸的加工傾向于使用純培養(yǎng)的乳酸菌等發(fā)酵菌種，可以使生產(chǎn)過(guò)程的微生物安全性及產(chǎn)品質(zhì)量更有保障，且乳酸菌發(fā)酵的食品更有益于人體健康[4-7]。研究[8]表明，在肉制品和魚制品的發(fā)酵過(guò)程中，接種純培養(yǎng)的乳酸菌等益生菌可以降低制品的pH值，抑制腐敗微生物和大腸桿菌等的生長(zhǎng)繁殖，降低發(fā)酵肉、魚制品中的揮發(fā)性鹽基氮含量，抑制生物胺的生成和積累，改善魚制品的色澤和白度，改善肉、魚制品的風(fēng)味。另有研究[9-11]指出，在蔬菜的發(fā)酵與腌制加工中，乳酸菌等益生菌可以降低亞硝酸鹽含量。

發(fā)酵肉腸的工藝條件的研究主要集中在發(fā)酵劑用量及配比，發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度、發(fā)酵時(shí)間等方面[2]，而關(guān)于發(fā)酵過(guò)程中鹽濃度的作用和影響的研究較少。目前大多數(shù)發(fā)酵香腸中添加的食鹽量為3%～8%[12-13]。鹽濃度對(duì)益生菌及腐敗菌具有重要的影響，此外食鹽攝入量過(guò)多會(huì)造成心腦血管疾病，特別是加大誘發(fā)高血壓的風(fēng)險(xiǎn)[14]，低鹽食品有益于人體健康。因此，非常有必要探究能否在添加更低濃度食鹽(≤3%)的條件下生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)且食用安全有保障的發(fā)酵肉制品。

在前期的研究中，依據(jù)文獻(xiàn)[2]，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間6～9 h的基礎(chǔ)上，添加0.08%乳酸菌和0.04%酵母進(jìn)行混合發(fā)酵可以得到風(fēng)味品質(zhì)俱佳的發(fā)酵香腸。本試驗(yàn)擬探討在合適的發(fā)酵溫度和時(shí)間段，低鹽濃度范圍內(nèi)不同鹽濃度對(duì)理化安全指標(biāo)和微生物安全的影響，期望為發(fā)酵香腸改良生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮豬肉：購(gòu)于湘潭某集市；

乳酸菌發(fā)酵劑：3.12×109CFU/g，北京川秀科技有限公司；

酵母發(fā)酵劑：3.95×109CFU/g，安琪酵母股份有限公司；

腸衣：譚氏百盛電子商務(wù)有限公司;

1-7二氨基庚烷、丹酰氯：分析純，德國(guó)AppliChen公司；

亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、硼砂、乙酸鋅、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氧化鎂、硼酸、鹽酸、甲基紅-乙醇指示劑、次甲基藍(lán)指示劑：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

MRS培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、VRBA、BGLB肉湯：生化試劑，上海盛思生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子分析天平：PTX-FA-110型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)顯酸度計(jì)：PHS-3BW型，上海雷磁儀器廠；

紫外分光光度計(jì)：Cary60型，安捷倫科技有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-4型，上海申生科技有限公司；

半微量定氮器：1765型，上海昕滬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：FN 101-2型，長(zhǎng)沙儀器儀表廠；

手提式滅菌鍋：YXQ-SG46-280S型，上海醫(yī)用儀器有限公司；

垂直流潔凈工作臺(tái)：SCW-CJ-1F型，蘇州市長(zhǎng)春電子儀器廠；

恒溫培養(yǎng)箱：SPX-250B-D型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬肉的腌制與發(fā)酵 取新鮮豬肥、瘦肉清洗干凈后，分別絞碎成肉糜；腌制劑：2.0%(g/100 g·肉糜，所有配料均如此)食鹽、0.2%味精、0.3%胡椒粉、0.2%姜粉、0.2%五香粉、2.4%白糖、0.1%紅曲粉、0.1%磷酸鹽、0.8%醬油、2.4%黃酒；瘦肉糜中加入準(zhǔn)備好的腌制劑在2 ℃冷藏柜腌制18 h，然后肥、瘦肉糜按3∶5 的質(zhì)量比混合，加入0.08%的乳酸菌和0.04%的酵母后灌腸，將其置于(32±1) ℃、相對(duì)濕度75%～80%條件下發(fā)酵9 h。

1.2.2 指標(biāo)分析 在瘦肉糜中添加不同量食鹽，經(jīng)過(guò)18 h低溫腌制后，添加混合菌種發(fā)酵9 h，以四分法取樣，分別對(duì)新鮮豬肉以及發(fā)酵0，6，9 h的肉腸進(jìn)行pH、亞硝酸鹽、TVB-N 以及微生物生長(zhǎng)情況的測(cè)定，以探究鹽濃度對(duì)香腸安全性指標(biāo)的影響。

(1) pH值的測(cè)定：取5 g樣品加入20 mL去離子水(pH 7.0)勻漿后震蕩30 min，再用數(shù)顯酸度計(jì)測(cè)定pH值[15]。

(2) 亞硝酸鹽的測(cè)定：按GB 5009.33—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》的方法二執(zhí)行。

(3) 揮發(fā)性鹽基氮：按GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法 半微量定氮法》執(zhí)行。

(4) 微生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定：以無(wú)菌方式取破碎樣品25.0 g，以10倍系列稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，選取2～3個(gè)適宜的稀釋度傾注或涂布平板。乳酸菌：用MRS培養(yǎng)基涂布平板，于(36±1) ℃培養(yǎng)(48±2) h后計(jì)數(shù)；菌落總數(shù)：用PCA培養(yǎng)基傾注平板，于(36±1) ℃培養(yǎng)(48±2) h后計(jì)數(shù)；大腸菌群：用VRBA傾倒雙層平板，于(36±1) ℃培養(yǎng)(24±1) h后計(jì)數(shù)；典型和可疑菌落，用BGLB肉湯做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次。用SPSS statistix 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行均值計(jì)算及方差分析，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05即表示差異顯著。作圖采用Origin 8.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過(guò)程中微生物變化

如表1所示，在不同鹽濃度腌制條件下，發(fā)酵初始乳酸菌數(shù)隨鹽濃度升高而略微減少但差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵6 h后，鹽濃度從低到高乳酸菌數(shù)分別增長(zhǎng)到(6.07±0.12)，(5.81±0.08)，(5.72±0.15)，(5.63±0.02) lg CFU/g。繼續(xù)發(fā)酵至9 h后，不同鹽濃度下乳酸菌數(shù)繼續(xù)增加，增長(zhǎng)速度和發(fā)酵6 h后保持一致，低鹽濃度時(shí)乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)速度較快，隨著鹽濃度的增加，乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)速度降低。4組中乳酸菌數(shù)在鹽濃度1.5%條件下增長(zhǎng)最快，當(dāng)鹽濃度高于2.5% 時(shí)，乳酸菌的增長(zhǎng)數(shù)量發(fā)生明顯變化，說(shuō)明2.5%以上的鹽濃度開始對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生鹽脅迫作用，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)影響乳酸菌的存活率[16]。

由表2可知，在發(fā)酵初始1.5%鹽濃度腌制條件下大腸菌群數(shù)明顯高于其他組，且具有顯著性差異(P<0.05)。發(fā)酵6，9 h后，不同鹽濃度下大腸菌群存在顯著的差異。1.5% 鹽濃度下發(fā)酵6，9 h后大腸菌群增幅最大，隨著鹽濃度的增加，大腸菌群數(shù)量增幅減少。試驗(yàn)結(jié)果顯示，肉腸的鹽濃度越高，對(duì)大腸菌群抑制性越強(qiáng)。其次，也有研究指出，乳酸菌發(fā)酵可以抑制大腸菌群的增值速度[17-18]，且大腸菌群與腌制、發(fā)酵香腸生物胺的生成和積累密切相關(guān)，抑制大腸菌群的生長(zhǎng)繁殖可以顯著降低香腸中生物胺含量[15,18]。腸道菌還與腌制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量相關(guān)，一般抑制腸道菌的生長(zhǎng)繁殖有利于降低腌制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量[9-11]。

如表3所示，腌制結(jié)束后3.0%鹽濃度腌制條件下菌落總數(shù)明顯低于其他組。發(fā)酵6，9 h時(shí)，不同鹽濃度發(fā)酵條件下菌落總數(shù)表現(xiàn)出顯著的差異性(P<0.05)，其規(guī)律均是隨著鹽濃度的升高而菌落總數(shù)相對(duì)變少。鹽濃度為1.5%時(shí)，菌落總數(shù)增長(zhǎng)幅度最大，當(dāng)鹽濃度增大到3.0%時(shí)，9 h時(shí)較6 h時(shí)菌落總數(shù)略有升高但差異不大，說(shuō)明3.0%鹽濃度能抑制益生菌發(fā)酵香腸中絕大部分微生物的生長(zhǎng)，與后面的pH值、亞硝酸鹽含量以及TVB-N的試驗(yàn)結(jié)果可以相互印證。

從上面3種微生物的生長(zhǎng)變化情況來(lái)看，鹽濃度對(duì)乳酸菌、大腸菌群、菌落總數(shù)均有負(fù)效應(yīng)，即隨著鹽濃度的增加，微生物數(shù)量相應(yīng)地下降，其中鹽濃度對(duì)菌落總數(shù)的影響最強(qiáng)，可能是香腸中大部分微生物的食鹽敏感性，導(dǎo)致隨著鹽濃度的增加，菌落總數(shù)明顯出現(xiàn)下降，并且腐敗菌及有害微生物的生長(zhǎng)也受到了抑制，有益于產(chǎn)品的品質(zhì)，這也是用食鹽腌制食物延長(zhǎng)保藏期的原理。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中pH變化

由圖1可知，腌制結(jié)束后，各組的pH基本上同等降低，各組之間無(wú)顯著性差異。不同鹽濃度條件下發(fā)酵6 h后，各組pH值均呈下降趨勢(shì)，其pH值在5.61～5.89，繼續(xù)發(fā)酵至9 h后pH值進(jìn)一步降低，其pH值降低至5.51～5.79。發(fā)酵時(shí)間相同時(shí)，鹽濃度越低，pH值下降幅度越大。這表明鹽濃度顯著影響了發(fā)酵香腸pH值的下降速度。鹽濃度影響肉腸中微生物的滲透壓，當(dāng)鹽濃度為3.0%時(shí)，pH值下降幅度小，說(shuō)明乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖可能受到了抑制。這個(gè)結(jié)果和前面乳酸菌及其他微生物的試驗(yàn)結(jié)果可以相互印證。一般情況下，發(fā)酵香腸的pH值都會(huì)下降[7,19]，pH值的降低有利于香腸中亞硝酸鹽的降低、發(fā)酵風(fēng)味的形成及保藏。

表1 鹽濃度對(duì)香腸乳酸菌數(shù)的影響?Table 1 Effect ofsalt concentration on lactic acid bacteria of sausage lg CFU/g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表2 鹽濃度對(duì)香腸大腸菌群數(shù)的影響?Table 2 Effect of salt concentration on the number of coliform bacteria in sausage lg CFU/g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表3 鹽濃度對(duì)香腸菌落總數(shù)的影響?Table 3 Effect ofsalt concentration on the number of bacterial colonies in sausage lg CFU/g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 鹽濃度對(duì)香腸pH的影響Figure 1 Effect of salt concentration on pH of sausage

2.3 發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽、TVB-N變化

從圖2可知，在原料中添加食鹽進(jìn)行18 h低溫腌制后，1.5% 及2.0%鹽濃度腌制條件下殘留的亞硝酸鹽量與其他組具有顯著性差異(P<0.05)，并且亞硝酸鹽的殘留量隨著鹽濃度的增大而增加。而香腸發(fā)酵6，9 h后，亞硝酸鹽殘留量與鹽濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，較低鹽濃度發(fā)酵條件下亞硝酸鹽的累積量始終低于較高鹽濃度的，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中較高鹽濃度發(fā)酵條件會(huì)累積更多的亞硝酸鹽。文獻(xiàn)[20]指出高食鹽含量肉制品中蛋白質(zhì)易與亞硝酸鹽反應(yīng)，因此使殘留的亞硝酸鹽濃度下降。本試驗(yàn)也得出一致結(jié)論，在不同鹽濃度腌制條件下，原料中的亞硝酸殘留量隨鹽度的增加而降低。而當(dāng)肉腸進(jìn)入發(fā)酵后，在乳酸菌的作用下，較高鹽濃度抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，從而可能影響乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解。文獻(xiàn)[20]還指出亞硝酸鹽殘留量隨著香腸pH值的降低而減少，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。此外，在一些關(guān)于酸菜發(fā)酵的文獻(xiàn)[11,21-22]記載，乳酸菌有降低亞硝酸鹽積累的作用。

圖2 鹽濃度對(duì)香腸亞硝酸鹽含量的影響Figure 2 Effect of salt concentration on nitrite content of sausage

從表4中可以看出，在原料中添加食鹽低溫腌制18 h后，雖然數(shù)據(jù)分析顯示不同鹽濃度條件下TVB-N的含量具有顯著差別，但是實(shí)際數(shù)值差異甚微。由于TVB-N主要來(lái)源于蛋白質(zhì)的分解或者腐敗[23]，因此在低溫腌制18 h的情況下，鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)的腐敗影響較小，可能是低溫抑制了腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖及代謝。發(fā)酵到6 h時(shí)，不同鹽濃度肉腸中的TVB-N含量增長(zhǎng)幅度隨著鹽濃度的增加而減少，較低鹽濃度增長(zhǎng)速度更快，而從6 h發(fā)酵到9 h后，1.5%鹽濃度發(fā)酵條件下T-VBN含量繼續(xù)升高，而其他鹽濃度發(fā)酵條件下TVB-N含量卻略有降低，其含量分別降至(2.73±0.05)，(2.70±0.02)，(2.69±0.01) mg/100 g。TVB-N主要是由于酶和細(xì)菌的作用使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，說(shuō)明2.0%的鹽濃度就可能對(duì)腐敗微生物或蛋白酶活性有一定的抑制作用。此外，也有研究[18,24]指出由于胺類能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與糖代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸反應(yīng)生成氨基酸，而使得TVB-N含量下降。

和前面微生物的試驗(yàn)結(jié)果相互印證，推測(cè)抑制腐敗菌和大腸菌群的生長(zhǎng)繁殖，可以降低發(fā)酵香腸中亞硝酸鹽及TVB-N的生成和積累。

表4 鹽濃度對(duì)香腸揮發(fā)性鹽基氮含量的影響?Table 4 Effect ofsalt concentration on TVB-N Content of Sausage mg/100 g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

研究了在1.5%～3.0%的鹽濃度條件下低溫腌制及接種人工菌種的發(fā)酵過(guò)程中香腸部分理化指標(biāo)的變化以及微生物生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)低鹽濃度亞硝酸鹽累積速度較慢，而高鹽濃度TVB-N含量累計(jì)速度更慢，雖然食鹽的添加能有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但濃度過(guò)高可能導(dǎo)致過(guò)咸以及延遲成熟，影響肉腸的口感與品質(zhì)；另外對(duì)發(fā)酵肉腸而言，pH值過(guò)低，則會(huì)使產(chǎn)品酸度過(guò)高，在口感上讓人難以接受，而pH值過(guò)高，會(huì)使產(chǎn)品無(wú)法顯現(xiàn)出發(fā)酵肉制品特有的香味[25]，因此，考慮到發(fā)酵肉腸的安全性以及食鹽作為調(diào)味品對(duì)風(fēng)味的影響，鹽濃度選擇2.0%～2.5%較為適宜。同時(shí)，綜合考慮亞硝酸鹽含量和微生物菌落數(shù)的變化，發(fā)酵時(shí)間以6 h較為合適。

食鹽的濃度同樣影響香腸發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化、香腸的凝膠特性和質(zhì)構(gòu)以及發(fā)酵香腸的風(fēng)味，因此這也是后期試驗(yàn)亟待研究的問(wèn)題。