成麗琴，張祝琴，陳厚早

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是中國(guó)死亡率最高的癌[1]。目前中國(guó)肝癌的治療首選手術(shù)切除，而不能手術(shù)的患者則以化療為主[2]。皮下注射干擾素α(interferon α, IFNα)作為一種簡(jiǎn)單、方便、價(jià)格相對(duì)便宜的方法，對(duì)提高肝癌患者遠(yuǎn)期生存率有明顯的效果[3-4]。

IFNα 是干擾素家族的I型IFN，因其抗腫瘤效應(yīng)而被熟知。一方面，它可以直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面，它可以通過(guò)促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)揮作用[5]。用IFN α處理6 h后，肝癌細(xì)胞系Huh7的cDNA基因表達(dá)譜芯片顯示，胞苷單磷酸激酶2(cytidine/uridine monopho-sphate kinase 2, CMPK2)的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[6]。CMPK2是位于線(xiàn)粒體的參與核苷酸補(bǔ)救途徑的酶。據(jù)報(bào)道，CMPK2在巨噬細(xì)胞的激活中發(fā)揮重要作用[7]。本研究擬對(duì)CMPK2在IFNα治療肝癌中的抗腫瘤免疫反應(yīng)作用進(jìn)行探討。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系Huh7、人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.1.2主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；胎牛血清(Gibco公司); CMPK2質(zhì)粒和抗體Anti-CMPK2 (Origene公司); Aldrich RNA提取裂解液Trizol(Invitrogen公司); 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和β-actin抗體(Sigma-Aldrich公司)；注射用重組人IFNα(天津未名生物醫(yī)藥有限公司); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司); 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(Vazyme公司); BCA蛋白定量試劑盒(賽默飛公司); 信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducers and activators of transcription 1, STAT1)的抗體和P-STAT1抗體(Cell Signaling Technology公司); 細(xì)胞裂解液RIPA和蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司); PVDF膜(Millipore公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(上海翊圣生物科技有限公司)；CellTiter-Glo 2.0三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate, ATP)熒光檢測(cè)試劑盒(Promega公司)。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng): 37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下，將Huh7和293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中。

1.2.2構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CMPK2的Huh7細(xì)胞: 分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI-HF和NotI-HF對(duì)pLV-EF1a-EGFP-N和pCMV6-ENTRY-CMPK2質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后膠回收，用T4連接酶鏈接目的片段，構(gòu)建過(guò)表達(dá)CMPK2的慢病毒質(zhì)粒。將CMPK2的慢病毒質(zhì)粒與 psPAX和pMD2.G質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集上清液，于4 ℃、4 000×g離心10 min，除去細(xì)胞碎片，用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾上清液，加入超速離心管中，40 000×g離心4 h，去上清，用1 mL DMEM完全培養(yǎng)基溶解沉淀，得到過(guò)表達(dá)CMPK2的慢病毒(lenti-CMPK2)。將得到的lenti-CMPK2感染Huh7細(xì)胞，48 h后用嘌呤霉素篩選出成功感染了lenti-CMPK2的細(xì)胞，得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CMPK2的Huh7細(xì)胞。以過(guò)表達(dá)EGFP的慢病毒作為對(duì)照(lenti-GFP)。

1.2.3RNA反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR 檢測(cè)CMPK2、白介素-1β (interleukin 1β, IL1β)、IL18、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor α, TNFα)、IL6、C-C模體趨化因子配體5 (C-C motif chemokine ligand 5, CCL5)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 的轉(zhuǎn)錄水平：用Trizol提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度及純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，再用RT-qPCR試劑盒檢測(cè)各基因的轉(zhuǎn)錄水平，以β-actin為內(nèi)參，用2-△△CT法分析各基因的相對(duì)表達(dá)量。所使用引物見(jiàn)表1和表2。

表1　Huh7細(xì)胞系RT-qPCR 引物序列

表2　RAW264.7細(xì)胞系RT-qPCR 引物序列

1.2.4Western blot檢測(cè)CMPK2、P-STAT1和STAT1的蛋白水平：收集細(xì)胞，用蛋白裂解液(RIPA)裂解細(xì)胞，超聲勻漿后離心提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜并封閉，分別用抗目的蛋白抗體(一抗)(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。次日室溫加相應(yīng)的二抗(1∶5 000)孵育，洗膜后進(jìn)行曝光、顯影和定影。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行分析。

1.2.5CellTiter-Glo ATP熒光檢測(cè)：將細(xì)胞計(jì)數(shù)后等量接種于24孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，分離培養(yǎng)基與細(xì)胞，取50 μL培養(yǎng)基或PBS重懸的細(xì)胞于96孔板中，加入等體積的CellTiter-Glo試劑，震蕩混勻5 min，室溫孵育10 min，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀讀出熒光信號(hào)。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　IFNα誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞CMPK2高表達(dá)

IFNα處理Huh7細(xì)胞6 h后CMPK2的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(95.44±4.26)，而LPS處理組Huh7細(xì)胞 CMPK2水平與對(duì)照組無(wú)明顯差別(圖1A)。IFNα處理后，其他免疫細(xì)胞激活時(shí)高表達(dá)的細(xì)胞因子IL1β、IL18和TNFα中，僅有IL1β的轉(zhuǎn)錄水平有上調(diào)(1.54±0.11)，但增加的水平遠(yuǎn)低于CMPK2(圖1B～D)。

2.2　IFNα誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞CMPK2表達(dá)的時(shí)間和濃度效應(yīng)

濃度為1×105U/L的IFNα即可使Huh7細(xì)胞中CMPK2的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(66.46±1.72)，當(dāng)IFNα濃度為(1～5)×106U/L時(shí)上調(diào)最為明顯(圖2A)。IFNα處理Huh7細(xì)胞1 h即可檢測(cè)到CMPK2 轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)(6.16±0.60)，6 hCMPK2轉(zhuǎn)錄水平到達(dá)高峰(102.10±1.03)，12 h仍維持在較高水平(90.84±1.44)，24 h出現(xiàn)明顯的回落(21.34±1.23)，并不斷下降，但到96 hCMPK2的轉(zhuǎn)錄水平仍高于無(wú)IFNα處理的對(duì)照組(圖2B)。1×106U/L IFNα 處理Huh7細(xì)胞6 h后，CMPK2的蛋白水平和STAT1的磷酸化水平也顯著上調(diào)(圖2C)。

2.3　通過(guò)感染慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CMPK2的Huh7細(xì)胞

在感染穩(wěn)定表達(dá)CMPK2慢病毒的Huh7細(xì)胞中，CMPK2的轉(zhuǎn)錄水平(20.76±0.94)和蛋白水平均顯著高于過(guò)表達(dá)GFP的對(duì)照組(圖3A, B)。

A.RT-qPCR detection of CMPK2 expression in Huh7 cells under the treatment of IFNα (1×106U/L), LPS(1mg/L) respectively; B,C,D.RT-qPCR detection of the expression of IL1β(B), IL18(C) and TNFα(D) in Huh7 cells after treatment with IFNα(1×106U/L)for 6 hours;*P<0.05,**P<0.0001 compared with the control group

A.RT-qPCR detection ofCMPK2 expression in Huh7 cells 6 hours after the treatment of IFNα with the indicated concentration (n=3); B.RT-qPCR detection ofCMPK2 expression in Huh7 cells after the treatment of IFNα(1×106U/L) for the indicated time (n=3); C.Western blot analysis of CMPK2, PY701-STAT1 and STAT1 in Huh7 cells with and without the stimulation of IFNα(1×106U/L) for 6 hours(n=4);*P<0.01,**P<0.001,***P<0.0001 compared with the control group

A.RT-qPCR detection ofCMPK2 expression in Huh7 cells, lenti-GFP treated Huh7 cells and lenti-CMPK2 treated Huh7 cells; B.Western blot analysis of CMPK2 in lenti-GFP treated Huh7 cells and lenti-CMPK2 treated Huh7 cells;*P<0.01 compared with the control group;#P<0.01 compared with lenti-GFP treated Huh7 cells

2.4　CMPK2上調(diào)Huh7細(xì)胞及其上清中ATP水平

IFNα處理6 h后，Huh7細(xì)胞及其上清中ATP水平顯著上調(diào)(圖4A～B)。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CMPK2的Huh7細(xì)胞及其上清中的ATP水平也顯著高于對(duì)照組(圖4C～D)。

2.5　CMPK2上調(diào)巨噬細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)

穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CMPK2的Huh7細(xì)胞的上清處理巨噬細(xì)胞6 h后，巨噬細(xì)胞中IL1β(1.70±0.08)、IL6(4.32±0.15)和CCL5(1.42±0.07)的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對(duì)照組(圖5A～D)。

3　討論

巨噬細(xì)胞在LPS和IFNα等刺激下激活向M1型巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中，CMPK2和炎性因子的表達(dá)水平顯著上調(diào)[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，IFNα處理后肝癌細(xì)胞系Huh7中CMPK2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平顯著上調(diào)，巨噬細(xì)胞激活過(guò)程中高表達(dá)的炎性因子在Huh7細(xì)胞中增加的水平遠(yuǎn)低于CMPK2，而LPS處理后Huh7細(xì)胞中 CMPK2水平無(wú)明顯改變。

STAT1Y701的磷酸化在干擾素刺激基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，STAT1Y701的磷酸化水平在IFNα處理0.5 h后顯著上調(diào)，到24 h下降至較低水平[9]。本研究中IFNα處理6 h后Huh7細(xì)胞中STAT1Y701的磷酸化水平顯著上調(diào)，IFNα處理Huh7細(xì)胞1 h即可檢測(cè)到CMPK2 轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，6 h CMPK2的轉(zhuǎn)錄水平到達(dá)高峰，到24 h CMPK2 的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯的回落，提示 STAT1Y701的磷酸化可能促進(jìn)CMPK2的轉(zhuǎn)錄激活。

CellTiter-Glo 2.0 Assay detects the ATP level in the cells(A) and supernatant(B) of Huh7 cells with or without the treatment of IFNα (1×106U/L) for 6 hours, and the cells(C) and supernatant(D) of CMPK2 overexpressing Huh7 cells; the ATP level is displayed by rLuciferase(RLU) luminescent signal；*P<0.01,**P<0.0001 compared with the control group

RT-qPCR detection ofIL1β(A),IL6(B),CCL5(C) andiNOS(D) in RAW264.7 cells 6 hours after the treatment of the supernatant of CMPK2 overexpressing Huh7 cells;*P<0.01,**P<0.0001 compared with the control group

圖5過(guò)表達(dá)CMPK2的Huh7細(xì)胞上清激活巨噬細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)

CMPK2催化單磷酸核苷變成相應(yīng)二磷酸核苷，可進(jìn)而促進(jìn)三磷酸核苷的合成[7]。現(xiàn)有報(bào)道，ATP等三磷酸核苷可以作用于巨噬細(xì)胞表面的嘌呤受體(purinergic receptor)，進(jìn)而激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)IL1β等細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)CMPK2顯著上調(diào)Huh7細(xì)胞及其上清中ATP的水平，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CMPK2的Huh7細(xì)胞上清處理巨噬細(xì)胞6 h后，巨噬細(xì)胞中IL1β、IL6和CCL5的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對(duì)照組。提示IFNα上調(diào)肝細(xì)胞中的CMPK2，增加ATP的水平，通過(guò)肝臟中枯否細(xì)胞的旁分泌，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為進(jìn)一步闡明IFNα治療肝癌中的抗腫瘤免疫作用提供了基礎(chǔ)，對(duì)提高干擾素治療效率，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療具有重要意義。