蔡　培，黃富強(qiáng)，趙　齊，周　賢，楊華瑜，毛一雷，張宏冰*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生理學(xué)系, 北京 100005;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 肝臟外科, 北京 100730)

中國(guó)肝癌發(fā)生率和病死率占世界肝癌總發(fā)病和總死亡的50%[1]，肝癌發(fā)病率居中國(guó)所有癌第4位，致死率居第2位[2]。目前手術(shù)切除仍是治療肝癌的首選，有效治療肝癌的藥物依舊匱乏。因此，研究肝癌發(fā)生的分子及病理改變有利于深入了解該疾病，找到有效的治療靶點(diǎn)。研究表明，微粒體谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1(microsomal glutathione S-transferase 1, MGST1)在人肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌、骨癌、急性髓性白血病和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等[3-6]多種癌中表達(dá)上調(diào)，然而其與肝癌的關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌組織中MGST1蛋白表達(dá)高于癌旁組織，在不同的肝癌細(xì)胞系中敲低和過(guò)表達(dá)MGST1后，探討其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和組織標(biāo)本：SPF級(jí)4～6周(質(zhì)量為10～14 g)BALB/c-nu雌性小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)(合格證號(hào)為：11400700262195)；原發(fā)性肝癌病例標(biāo)本(由北京協(xié)和醫(yī)院肝膽科提供)，所有肝癌患者已簽署知情同意書，本研究已獲得北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)書。

1.1.2細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系MHCC97H和HCCLM3(復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所)；HepG2、SK-Hep-1、Hep3B2.1-7和HEK293T(ATCC)；HepG2.2.15、Bel7402(北京大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所)；慢病毒載體PLL3.7及其包裝質(zhì)粒(廈門大學(xué)尤涵教授惠贈(zèng))；慢病毒載體pCDH及其包裝質(zhì)粒(Addgene公司)。

1.1.3主要試劑：胰蛋白酶、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；Trizol試劑(Sigma Aldrich公司)；ReverTra Ace qPCR RT Kit(東洋紡生物科技有限公司)；TransStart SYBR Green qPCR SuperMix及大腸桿菌感受態(tài)(北京全式金生物技術(shù)公司)；MGST1一抗(北京華興博創(chuàng)生物技術(shù)中心)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；GAPDH一抗、兔抗和鼠抗的二抗(ABclonal公司)；HpaⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ(TaKaRa公司)；Transwell小室(BD公司)。

1.2　方法

1.2.1敲低細(xì)胞株的構(gòu)建：靶向人MGST1的序列由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5′-TGCCAAGAAGTATCTTCGAATTCAAGAGATTCGAAG ATACTTCTTGGCTTTTTTC-3′(含HpaⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-TCGAGAAAAAAGCCAAGAAGTATCT TCGAATCTCTTGAATTCGAAGATACTTCTTGGCA-3′(含XhoⅠ酶切位點(diǎn))。將上下游引物與PLL3.7質(zhì)粒載體經(jīng)酶切連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a，測(cè)序鑒定正確后命名為pll3.7-shMGST1。將PLL3.7 shRNA及其包裝質(zhì)粒VSVG、REV、pMDL轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后72 h經(jīng)0.45 μm濾膜收集病毒液，用于感染MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞系。感染效率可通過(guò)綠色熒光蛋白的表達(dá)初步判定。

1.2.2過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建：人MGST1 CDS區(qū)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。經(jīng)酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ插入載體pCDH中，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后命名為pCDH-MGST1。將pCDH及其包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2G轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后72 h經(jīng)0.45 μm濾膜收集病毒液，用于感染SK-Hep-1細(xì)胞系。感染效率可通過(guò)綠色熒光蛋白的表達(dá)初步判定。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MGST1 mRNA的表達(dá)：Trizol 裂解提取細(xì)胞的mRNA，并按Tobybo公司的反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)qPCR Mix的說(shuō)明書設(shè)置反應(yīng)體系及反應(yīng)條件(引物序列見(jiàn)表1)。

表1　qPCR引物序列Table 1　qPCR primer sequence

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)MGST1蛋白表達(dá)：以含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞或組織，破碎后的樣品于98 ℃金屬浴中加熱10 min，取50 μg蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。以β-actin蛋白(細(xì)胞)和GAPDH蛋白(組織)的表達(dá)水平為對(duì)照。

1.2.5克隆形成：將6 000個(gè)MHCC97H和HCCLM3及2 000個(gè)SK-Hep-1細(xì)胞鋪于10 cm培養(yǎng)皿中，MHCC97H細(xì)胞于鋪完16 d、HCCLM3細(xì)胞鋪完21 d、SK-Hep-1細(xì)胞鋪完13 d棄去上清，PBS潤(rùn)洗，甲醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，拍照并統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)目。每種細(xì)胞平行鋪3個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.6Tranwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將650 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下室(培養(yǎng)板)，Transwell的小室置于細(xì)胞培養(yǎng)皿的孔中，上室加入200 μL的2.7×106個(gè)/mL無(wú)血清培養(yǎng)基的MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞懸液以及2×105個(gè)/mL無(wú)血清培養(yǎng)基的 SK-Hep-1細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h后，以4%甲醛溶液固定，結(jié)晶紫染色后觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.7裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)：取100 μL濃度為1×107個(gè)/mL的MHCC97H shMGST1和shV的細(xì)胞懸液接種于5周左右的BALB/c-nu雌性裸鼠背部皮下，每組9只。接種后每2～3 d觀察1次，待腫瘤出現(xiàn)后，隔日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤塊最大直徑(L)和最小直徑(W)，以V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤的體積。測(cè)量并記錄細(xì)胞在裸鼠中成瘤時(shí)間、腫瘤體積及裸鼠生存時(shí)間(腫瘤體積V>1 000 mm3時(shí)記為裸鼠死亡)。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　MGST1在人肝癌組織中高表達(dá)

在24對(duì)人肝癌組織中，MGST1蛋白在腫瘤內(nèi)的表達(dá)高于瘤旁的有17對(duì)(70.83%)(圖1)。

2.2　敲低及過(guò)表達(dá)細(xì)胞株中MGST1蛋白及mRNA的表達(dá)

人肝癌細(xì)胞系中MGST1均存在不同程度的表達(dá)，MHCC97H、HCCLM3細(xì)胞的MGST1蛋白相對(duì)表達(dá)量較高，SK-Hep-1細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量較低(圖2A)。所以本課題在MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞中敲低MGST1，在SK-Hep-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MGST1。與對(duì)照細(xì)胞相比，MGST1敲低的MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞中，MGST1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.001)(圖2B-C)；MGST1過(guò)表達(dá)的SK-Hep-1細(xì)胞中，MGST1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著上升(P<0.01)(圖2D)。

2.3　MGST1對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

敲低MGST1抑制MHCC97H細(xì)胞(P<0.001)和HCCLM3細(xì)胞(P<0.01)的克隆形成能力，過(guò)表達(dá)MGST1促進(jìn)肝癌細(xì)胞克隆形成能力(P<0.05)(圖3)。

2.4　MGST1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響

敲低MGST1抑制MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞遷移(P<0.01)，過(guò)表達(dá)MGST1可促進(jìn)SK-Hep-1細(xì)胞遷移(P<0.01)(圖4)。

T.human HCC tissues; N.adjacent tissues圖1　人肝癌組織中腫瘤區(qū)域MGST1的表達(dá)高于瘤旁組織Fig 1　MGST1 was higher expressed in HCC tissues than adjecent liver tissues

A.expression of MGST1 in HCC cell line; B, C,D.expression of MGST1 protein detected by Western blot (up) and relative expression ofMGST1 mRNA detected by qPCR(down);*P<0.01,**P< 0.001 compared with control cells

2.5　敲低MGST1抑制肝癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力

與對(duì)照組相比，MGST1敲低的MHCC97H細(xì)胞裸鼠成瘤時(shí)間滯后(P<0.01)，腫瘤體積減小(P<0.001)，并且生存期延長(zhǎng)(P<0.001)(圖5A-C)。

3　討論

過(guò)去20年肝癌致死的病例持續(xù)上升。目前治療肝癌的方法有：手術(shù)切除、肝移植手術(shù)、射頻消融術(shù)、肝動(dòng)脈栓塞術(shù)和索拉非尼[7]。然而大多數(shù)肝癌患者確診于疾病進(jìn)展期，只有索拉菲尼治療可以輕度提高部分患者的生存期[8]。因此，繼續(xù)深入研究肝癌，探索新的靶向基因以及藥物十分必要。

MGST1在人體各器官?gòu)V泛分布[9]。大量報(bào)道MGST1在多種癌中表達(dá)上調(diào)[3-6]，然而對(duì)MGST1在癌中發(fā)揮的具體作用研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)MGST1蛋白在70.83%的人肝癌樣本中表達(dá)高于其癌旁組織。此結(jié)果與既往報(bào)道共同提示MGST1在癌發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建敲低和過(guò)表達(dá)MGST1的載體后，在低表達(dá)MGST1的SK-Hep-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MGST1；在高表達(dá)MGST1的MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞中敲低MGST1?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低MGST1抑制細(xì)胞增殖及克隆形成能力，過(guò)表達(dá)MGST1促進(jìn)細(xì)胞增殖及克隆形成能力。這一結(jié)果與MGST1在肺癌細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖及克隆形成的生物學(xué)功能相似[10]。之前的研究表明MGST1高表達(dá)可能與癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。為探討MGST1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響，本研究檢測(cè)了敲低及過(guò)表達(dá)MGST1后細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示，敲低MGST1抑制細(xì)胞遷移能力，過(guò)表達(dá)MGST1促進(jìn)細(xì)胞遷移能力。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中，MGST1蛋白敲低的細(xì)胞裸鼠成瘤時(shí)間滯后，腫瘤體積減小，并且裸鼠生存期延長(zhǎng)。這些結(jié)果提示MGST1過(guò)表達(dá)促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。

A.MGST1 knockdown suppressed the colony formation of MHCC97H cells; B.depletion of MGST1 inhibited the colony formation of HCCLM3 cells; C.MGST1 over-expression promoted the colony formation of SK-Hep-1 cells;*P<0.05,**P< 0.01,***P< 0.001 compared with control cells

綜合以上結(jié)果，本研究表明MGST1在半數(shù)以上肝癌樣品中表達(dá)上調(diào)。MGST1可促進(jìn)人肝癌細(xì)胞系的增殖、遷移。敲低MGST1抑制肝癌細(xì)胞在裸鼠成瘤和發(fā)展。因此，MGST1過(guò)度表達(dá)促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展，可作為治療肝癌的新靶點(diǎn)。

A.MGST1 knockdown inhibited the migration of MHCC97H cells; B.MGST1 silencing suppressed the migration of HCCLM3 cells; C.ectopic expression of MGST1 increased the migration of SK-Hep-1 cells;*P<0.01 compared with control cells

A.tumor free curve of nude mice transplanted with shV or shMGST1 MHCC97H cells; B.tumor volume was monitored after tumor initiation; C.survival curve of nude mice transplanted with shV or shMGST1 MHCC97H cells;*P<0.01,**P<0.001 compared with control group