張運婷，師尚禮，苗陽陽，康文娟，張翠梅，周 彤，白逸偉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè) 可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

根瘤菌-豆科植物共生體系的共生固氮作用具有較大的經(jīng)濟和社會效益，人工接種根瘤菌在提高經(jīng)濟作物和牧草的質(zhì)量和產(chǎn)量、改良土壤肥力、改善生態(tài)環(huán)境等方面具有重要意義[1]。生產(chǎn)中常以增施根瘤菌劑來提高苜蓿品質(zhì)和產(chǎn)量[2-4]，但根瘤菌劑存在質(zhì)量不穩(wěn)定、活菌數(shù)少、占瘤率低、專一性強、接種工作繁瑣等問題[5]，使根瘤菌劑的應用處于徘徊不前的狀態(tài)。因此，急需探尋促使優(yōu)良根瘤菌在植物生長過程中運移至種子并穩(wěn)定傳代，免除根瘤菌的接種環(huán)節(jié)的方法。張淑卿，李劍峰，等[6-10]研究發(fā)現(xiàn)，根瘤菌存在于苜蓿體內(nèi)，在根系中數(shù)量較大并可向上運移并定殖于莖、葉、花等組織，但運移及定殖效果不佳。添加外源物質(zhì)對根瘤菌的侵染、結(jié)瘤固氮和運移與定殖有促進作用[11-14]，目前僅對有限的幾種外源促進劑進行研究，且效果仍不理想，探尋促進根瘤菌運移和定殖的外源物質(zhì)，對促使優(yōu)良根瘤菌在植株生長過程中侵染根系進入其內(nèi)部、運移并定殖于種子器官內(nèi)，形成目標根瘤菌與苜蓿種子共生體具有重要的意義。

磷酸二氫鉀(KH2PO4)在農(nóng)業(yè)上被作為高效磷鉀復合肥，廣泛用于作物栽培。苗淑杰等[15]研究表明磷是影響豆科作物結(jié)瘤固氮的一個非常重要的因素。姚玉波[16]在對大豆根瘤固氮特性的研究中發(fā)現(xiàn)，磷素營養(yǎng)對大豆根瘤固氮有明顯影響，砂培條件下，大豆植株根瘤固氮量和固氮率隨著磷素水平的提高均呈單峰曲線變化，大豆根瘤固氮率隨著磷肥施用量的增加整體呈上升趨勢。李富寬[17]研究發(fā)現(xiàn)，施磷肥和接種根瘤菌顯著改善了紫花苜蓿根瘤的結(jié)瘤，施磷后，紫花苜蓿結(jié)瘤率明顯提高,單株根瘤數(shù)和根瘤重均顯著增加，根瘤共生固氮的效果提高。增施磷鉀肥料和接種根瘤菌均可提高豆科作物根瘤固氮能力[18-20]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，磷元素可使根瘤增大[21]、提高根瘤菌活性[22]，刺激根瘤菌繁殖，促使根瘤菌鞭毛運動，有利于根瘤菌接近和侵入根毛，形成根瘤[23]。近年來，有關(guān)KH2PO4對根瘤菌的影響研究主要集中在菌株活性、結(jié)瘤固氮等方面，而KH2PO4對根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運移和定殖有何影響尚不清楚。因此，試驗通過添加不同濃度KH2PO4并接種不同來源的熒光標記根瘤菌，研究KH2PO4對根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運移及定殖的影響，以期為促進根瘤菌運移和定殖至種子提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株：草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室提供青色熒光標記根瘤菌RzhizobiumLH3436f(3436f，其原始菌株分離自WL343HQ紫花苜蓿)[24]、Ensifermeliloti12531f(12531f，其原始菌株為購自中國科學院微生物保藏中心的中華苜蓿根瘤菌)和RzhizobiumGN5f(gn5f，其原始菌株分離自甘農(nóng)5號紫花苜蓿)。

供試種子：試驗材料購自美國Monsanto 公司的WL343HQ紫花苜蓿種子(Medicagosativacv.WL343HQ)，發(fā)芽率為84.5%。

KH2PO4：購自國藥集團化學試劑有限公司，純度等級為分析純。

培養(yǎng)基：采用TY培養(yǎng)基(胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，CaCl2·2H2O 0.872 6 g，蒸餾水1 L；pH 7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂16 g)，進行菌株的保存、活化、培養(yǎng)和根瘤菌數(shù)量檢測。

營養(yǎng)液：Hoagland有氮營養(yǎng)液和Hoagland無氮營養(yǎng)液[25-26]。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)液及菌液制備 將KH2PO4置于無菌三角瓶中，無菌水溶解并過3次無菌濾膜(0.22 μm)，濃度設(shè)置為0(CK1)、50、100、200、400、600 mg/L，在無菌操作臺內(nèi)按濃度梯度加入TY液體培養(yǎng)基中，定量分裝于50 mL三角瓶內(nèi)并用無菌封口膜封口，同時將保存的3株標記根瘤菌活化后接入TY液體培養(yǎng)基，用無菌液體培養(yǎng)基調(diào)制成D600nm=0.5的菌液。

1.2.2 KH2PO4標記根瘤菌菌液制備 將3株標記根瘤菌菌液按照每瓶1 mL分別加入裝有不同濃度的KH2PO4液體培養(yǎng)基內(nèi)，每處理重復4次，28℃、180 r/min 搖床內(nèi)培養(yǎng)7 d(未添加KH2PO4的3436f菌液為CK1，未添加KH2PO4的12531f菌液為CK2，未添加KH2PO4的gn5f菌液為CK3)。

1.2.3 幼苗的培育 沙培法栽培苜蓿幼苗[13]，選取健康、飽滿的WL343HQ紫花苜蓿種子20 g，在無菌操作臺內(nèi)醫(yī)用碘伏消毒2 min后用無菌水清洗3～4次，無菌濾紙吸干水分待用。細沙洗凈烘干，121℃、102.9 kPa、26 min滅菌3次后裝入底部扎有網(wǎng)眼的塑料杯(直徑10 cm，深12 cm，500 g/杯)[13]，放入水培盒。每杯播種45粒已消毒的種子，表面覆蓋已滅菌干沙1 cm。每處理水培盒內(nèi)加有氮營養(yǎng)液1 L，使沙杯內(nèi)沙子完全濕潤，發(fā)芽前以無菌水補充水分。

1.2.4 幼苗根系接菌 待苜蓿幼苗長出真葉后，將3株標記根瘤菌分別等量接種于添加不同濃度KH2PO4(2.1篩選出的每株標記根瘤菌對應的3個濃度和0濃度)的液體培養(yǎng)基內(nèi)制成菌液(表1)，28℃、180 r/min條件下?lián)u床內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別用針管向苜蓿沙培杯的沙子里注射30 mL菌液，確保除幼苗根系以外其他部位不接觸菌液，以單獨添加無菌水處理為對照(CK4)。接種后每個水培盒每隔10 d澆灌無氮營養(yǎng)液500 mL，無菌水補充水分，至60 d苜蓿植株收獲。

表1 試驗處理

1.3 測定指標與方法

1.3.1 3株標記根瘤菌適宜生長的KH2PO4濃度篩選 紫外分光光度計測定第1、2、3、4、5和6 d菌液D600nm值。根據(jù)吸光度值選擇出每株標記根瘤菌適宜生長的3個KH2PO4濃度，用于苗期試驗。

1.3.2 苜蓿幼苗體內(nèi)標記根瘤菌運移與定殖狀況的檢測 參考文獻[14]的根瘤菌運移及定殖的檢測。隨機挖取3株幼苗，前15 d每隔5 d檢測1次，分離為根、莖、葉，后30 d每隔10 d檢測1次，分離為根、下部莖、下部葉、上部莖、上部葉(從第4個真葉處分上部和下部)，稱取1 g。無菌操作臺內(nèi)醫(yī)用碘伏消毒1～2 min，放入已滅菌的5 mL離心管中，加2 mL無菌水和3～5粒小鋼珠，高通量組織研磨器研磨后離心(4 000 r/min，5 min)，依次吸取0.2 mL均勻涂布于TY固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h。暗室內(nèi)用手提紫外燈(波長336 nm)觀察記錄熒光標記根瘤菌落個數(shù)。

1.3.3 苜蓿幼苗單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤等級檢測 最后1次檢測苜蓿體內(nèi)標記根瘤菌運移與定殖狀況時(即接種第45 d)，各處理隨機選取5株，測定其單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤等級，根瘤等級劃分采用5分制法既1分為中空的死亡根瘤；2分為橫切面呈灰白色的無效根瘤；3分為直徑小于0.5 mm的粉色根瘤；4分為直徑處于0.5～1 mm的粉色根瘤；5分為直徑大于1 mm的粉色根瘤[27]。

1.3.4 苜蓿幼苗生長指標測定 最后1次檢測苜蓿體內(nèi)標記根瘤菌運移與定殖時(即接種第45 d)，各處理隨機選取5株完整植株，測定其單株葉片數(shù)(復葉)；數(shù)每株幼苗的葉片數(shù)；株高、根長采用直尺直接測量，地上鮮重、根鮮重，濾紙吸干表面水分后電子天平上稱鮮質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 19.0進行數(shù)據(jù)處理和方差分析，對同一生長時間同一部位不同處理進行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)作多重比較；采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3株標記根瘤菌適宜生長的KH2PO4濃度篩選

適宜濃度的KH2PO4可促進標記根瘤菌生長。隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長，3436f，12531f和gn5f菌液的OD值均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

3436f菌液培養(yǎng)1和3 d，添加各濃度KH2PO4的3436f菌液D600nm值與CK1差異不顯著(P>0.05)。2 d和6 d時，除添加600 mg/L KH2PO4外，其他濃度處理的菌液D600nm值均顯著高于CK1，其中，菌液D600nm值最高的處理均為添加100 mg/L KH2PO4，分別顯著高出CK134.16%、47.36%(P<0.05)。4 d時，添加100 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值顯著高出CK121.61%(P<0.05)，其他濃度處理與CK1差異不顯著(P>0.05)。5 d時，添加50、100、200 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值顯著高于CK1，其中，在100 mg/L濃度下達到最大值，顯著高出CK130.31%(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同濃度KH2PO4處理下的3436f菌液D600nm值Fig.1 Effects of different concentrations of KH2PO4 on D600nm values of 3436f 注：同一天不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

12531f菌液培養(yǎng)1 d時，添加50 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值最高，但與CK2差異不顯著(P>0.05)。2 d添加100 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值最高，顯著高出CK215.06%(P<0.05)。3 d時，添加100、400 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值顯著高于CK2(P<0.05)，分別高出12.74%、15.79%。4～6 d時，添加50，100和400 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值均顯著高于CK2(P<0.05)，其中,5 d時添加400 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值達到最大值，顯著高出CK234.13%(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同濃度KH2PO4處理下的12531f菌液D600nm值Fig.2 Effects of different concentrations of KH2PO4 on D600nm values of 12531f

gn5f菌液培養(yǎng)1～2 d時，各濃度KH2PO4處理的菌液D600nm值未顯著高于CK3。3～5 d時，添加50，100和200 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值均顯著高于CK3(P<0.05)，其中，5 d添加50 mg/L KH2PO4的菌液D600nm值達最大，顯著高出CK 41.25%(P<0.05)。6 d時，除添加600 mg/L KH2PO4外，其他濃度處理的菌液D600nm值均顯著高于CK3，其中菌液D600nm值最高的處理均為添加100 mg/L KH2PO4，顯著高出CK329.31%(P<0.05)(圖3)。

促進3株標記根瘤菌生長的適宜KH2PO4濃度不同，分別選出3個適宜濃度進行苗期試驗，其中，3436f生長的KH2PO4適宜濃度為50，100和200 mg/L，12531f為50，100和400 mg/L，gn5f為，50，100和200 mg/L。

圖3 不同濃度KH2PO4處理下的gn5f菌液D600nm值Fig.3 Effects of different concentrations of KH2PO4 on D600nm values of gn5f

2.2 KH2PO4對標記根瘤菌在WL343HQ紫花苜蓿體內(nèi)的運移及定殖

接種5 d時，3株標記根瘤菌均可在苜蓿根系定殖，其中12531f添加100 mg/L KH2PO4接種檢測到的標記根瘤菌數(shù)量顯著高于其他處理，高出單獨接種12531f處理202.01%(P<0.05)。試驗10 d時，苜蓿根系檢測到大量標記根瘤菌，3436f添加50 mg/L KH2PO4試驗接種的苜蓿根系標記根瘤菌定殖數(shù)量達到最大值27 075.12 cfu/g，顯著高出單獨接種3436f處理1 457.84%(P<0.05)，12531f添加50 mg/L KH2PO4接種的定殖數(shù)量顯著高出單獨接種12531f處理179.85%(P<0.05)，Rzhizobium(gn5f)添加100 mg/L KH2PO4接種的定殖數(shù)量顯著高出單獨接種gn5f處理213.95%(P<0.05)。試驗進行到15～45 d時，苜蓿根系內(nèi)各標記根瘤菌仍然可以定殖，但是定殖數(shù)量逐漸減少(圖4)。

圖4 KH2PO4處理下WL343HQ紫花苜蓿根系內(nèi)標記根瘤菌的數(shù)量Fig.4 Effect of KH2PO4 on the number of labeled rhizobia in WL343HQ alfalfa root

接種5 d時，3436f，12531f和gn5f均可運移至苜蓿莖部，CK未檢測到標記根瘤菌。10 d時，運移并定殖至莖部的標記根瘤菌數(shù)量增加，3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿莖部標記根瘤菌定殖數(shù)量達到最大值674.55 cfu/g，顯著的高出單獨接種3436f處理71.23%(P<0.05)，12531f添加50 mg/L KH2PO4接種的定殖數(shù)量顯著高出單獨接種數(shù)量12531f處理848.87%(P<0.05)，gn5f添加200 mg/L KH2PO4接種的定殖數(shù)量顯著高出單獨接種gn5f處理498.27%(P<0.05)。15 d時，莖部標記根瘤菌定殖數(shù)量較少，在69.51 cfu/g。25 d時3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿體內(nèi)標記根瘤菌首先運移至上部莖，定殖數(shù)量為19.20 cfu/g，35 d時12531f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿體內(nèi)標記根瘤菌也運移至上部莖。45 d時，除gn5f添加200 mg/L KH2PO4接種外，其他處理和CK均未在莖內(nèi)檢測到標記根瘤菌(圖5)。

圖5 KH2PO4處理下WL343HQ紫花苜蓿莖內(nèi)標記根瘤菌的數(shù)量Fig.5 Effect of KH2PO4 on the number of labeled rhizobia in WL343HQ alfalfa

5 d時，標記根瘤菌未運移至苜蓿葉部。10 d時，3436f，12531f和gn5f均可在苜蓿體內(nèi)運移至葉部，其中，3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿葉部標記根瘤菌定殖數(shù)量為149.97 cfu/g，顯著高于其他處理(P<0.05)。15 d時，gn5f添加200 mg/L KH2PO4接種的苜蓿葉部標記根瘤菌定殖數(shù)量顯著高于單獨接種gn5f和其他，高出單獨接種gn5f處理323.99%(P<0.05)。25 d時，僅在gn5f添加200 mg/L KH2PO4接種的苜蓿下部葉內(nèi)檢測到標記根瘤菌。35 d時，3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿上部葉有根瘤菌定殖，其他處理和CK未檢測到。45 d時，葉部未檢測到標記根瘤菌(圖6)。

標記根瘤菌運移及定殖高峰期在10 d。10 d時，3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿體內(nèi)標記根瘤菌定殖數(shù)量在根系內(nèi)為27 075.12 cfu/g，運移至莖部為674.44 cfu/g，運移至葉部為149.972 cfu/g，均顯著高于其他濃度處理(P<0.05)，12531f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿體內(nèi)標記根瘤菌定殖數(shù)量在根系內(nèi)為19 193.63 cfu/g，運移至莖部為435.53 cfu/g，均顯著高于單獨接種12531f處理(P<0.05)，gn5f添加200 mg/L接種的莖內(nèi)標記根瘤菌數(shù)量為630.01 cfu/g，顯著高于其他濃度處理(P<0.05)。

圖6 KH2PO4處理下WL343HQ紫花苜蓿葉內(nèi)標記根瘤菌的數(shù)量Fig.6 Effect of KH2PO4 on the number of labeled rhizobia in WL343HQ alfalfa leaf

由此表明，3株標記根瘤菌均可在WL343HQ紫花苜蓿根系內(nèi)定殖，添加KH2PO4有利于標記根瘤菌運移和定殖于莖、葉部。3436f在苜蓿體內(nèi)運移速度較快，定殖數(shù)量較大，12531f在添加KH2PO4接種后35 d也可運移定殖于上部莖，gn5f在添加KH2PO4接種后45 d可運移定殖于上部莖，表明3株標記根瘤菌在苜蓿體內(nèi)的運移及定殖規(guī)律不同。

2.3 標記根瘤菌添加KH2PO4接種對苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)及根瘤等級

3株標記根瘤菌添加適宜濃度KH2PO4后接種可增加苜蓿幼苗單株結(jié)瘤數(shù)，提高根瘤等級(表2)。當3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)和根瘤等級分別顯著高出CK4279.04%、111.16%(P<0.05)，分別顯著高出單獨接種3436f處理245.90%、73.85%(P<0.05)，12531f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿根瘤等級顯著高出CK493.13%(P<0.05)。

表2 3436f，12531f和gn5f添加KH2PO4接種處理下苜蓿 幼苗單株結(jié)瘤數(shù)及根瘤等級

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.4 標記根瘤菌添加KH2PO4接種對苜蓿幼苗的生長

添加適宜濃度KH2PO4不僅可以促進根瘤菌在苜蓿體內(nèi)的運移及定殖，還可促進幼苗生長。3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿單株葉片數(shù)分別顯著高出CK和單獨接種3436f處理75.49%、72.63%(P<0.05)，株高分別顯著高出CK4和單獨接種3436f處理79.19%、75.32%(P<0.05)，根長分別顯著高出CK4和單獨接種3436f處理55.23%、45.11%(P<0.05)，12531f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿單株葉片數(shù)分別顯著高出CK4和單獨接種的12531f處理75.28%、69.50%(P<0.05)，株高顯著高CK452.43%(P<0.05)，gn5f添加100 mg/L KH2PO4接種的苜蓿單株葉片數(shù)分別顯著高出CK4和單獨接種gn5f處理82.73%、103.81%(P<0.05)，gn5f添加200 mg/L KH2PO4接種的苜蓿根長顯著高出CK463.21%(P<0.05)(表3)。

表3 3436f，12531f和gn5f 添加KH2PO4接種處理下 苜蓿幼苗的單株葉片數(shù)、株高和根長

3株標記根瘤菌添加適宜濃度KH2PO4接種可增加苜蓿幼苗的生物量。3436f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿幼苗地上鮮重顯著高出CK4和單獨接種3436f處理214.29%、175.00%(P<0.05)，根鮮重顯著高出CK4和單獨接種3436f處理238.89%、165.22%(P<0.05)。12531f添加50 mg/L KH2PO4接種的苜蓿地上鮮重顯著高CK4128.57%(P<0.05)，根鮮重有所增加但差異不顯著(P>0.05)，gn5f添加200 mg/L KH2PO4接種的苜蓿地上鮮重顯著高出CK4和單獨接種gn5f處理176.19%、123.08%(P<0.05)，根鮮重顯著高出CK4和單獨接種gn5f處理222.22%、190.00%(P<0.05)。

表4 3436f，12531f和gn5f 添加KH2PO4接種 處理下苜蓿的生物量

3 討論

3.1 KH2PO4對標記根瘤菌生長及在苜蓿幼苗體內(nèi)運移和定殖

磷對根瘤菌在豆科植物根際的生長、繁殖以及侵染根系、結(jié)瘤和與豆科植物共生固氮都有重要作用，曹景勤[28]在進行某些土壤因素對根瘤菌存活影響的研究發(fā)現(xiàn)，土壤中有效磷含量高可促進根瘤菌的存活和繁殖。試驗發(fā)現(xiàn)，KH2PO4可促進記根瘤菌的生長，但適宜濃度不同，適宜3436f和gn5f生長的KH2PO4濃度為50，100和200 mg/L，12531f為50、100、400 mg/L，說明不同菌株對KH2PO4的敏感程度不同，這與周可等[22]進行的添加KH2PO4的培養(yǎng)基材料對苜蓿根瘤菌活性的影響研究結(jié)果相似。

對于根瘤菌在苜蓿幼苗體內(nèi)運移及定殖的影響，已有研究表明，豆科植物與根瘤菌的共生固氮過程中必須有磷素的參與[29-32]，且磷可調(diào)控根瘤菌群體感應系統(tǒng)，從而影響根瘤菌與根毛的識別依附，促進二者信號交流，促進根毛變形和共生結(jié)瘤[33-34]。苗陽陽等[12]在研究硼、赤霉素對根瘤菌運移與定殖的影響中發(fā)現(xiàn)，適宜濃度硼、赤霉素可促進幼苗體內(nèi)根瘤菌的運移及定殖，同時可提高幼苗單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤重，促進幼苗生長，但不同濃度硼、赤霉素對苜蓿各部位的根瘤菌運移及定殖影響不同，且對內(nèi)生根瘤菌和外源根瘤菌的影響也不同，認為菌株不同，對硼、赤霉素的敏感性不同，生長和在促進運移時需要的硼、赤霉素濃度也不同。試驗中3436f 添加50 mg/L KH2PO4后可長期大量定殖于苜蓿根系，并快速運移至莖和上部葉中；12531f 添加50 mg/L KH2PO4后可大量定殖于根系，并可運移至上部莖；gn5f添加200 mg/L KH2PO4后可穩(wěn)定定殖于根系和莖內(nèi)。試驗結(jié)果證實菌株不同，對KH2PO4的敏感性不同，生長和在促進運移時需要的KH2PO4濃度也不同，試驗中KH2PO4對根瘤菌運移和定殖的促進作用可能由于添加KH2PO4調(diào)控了根瘤菌群體感應系統(tǒng)，提高根瘤菌的存活和侵染能力，從而促進根瘤菌的結(jié)瘤和在苜蓿體內(nèi)的運移和定殖。

3.2 標記根瘤菌添加KH2PO4接種對苜蓿幼苗生長的影響

在磷對大豆結(jié)瘤固氮和接種根瘤菌大豆的共生固氮與磷素營養(yǎng)的關(guān)系的研究中表明，磷可增加大豆植株的根瘤數(shù)[35-36]，在大豆結(jié)瘤固氮對磷素的需求試驗表明，在大豆生長初期，隨著磷濃度的增加，根瘤數(shù)、根瘤干重均增加[15]。在氮、磷、鉀對異果山綠豆結(jié)瘤固氮特性的研究中發(fā)現(xiàn)，有磷處理的植株結(jié)瘤多、根瘤大[37]。在磷與苜蓿固氮能力研究中發(fā)現(xiàn)，磷在苜蓿的生長和結(jié)瘤固氮過程中發(fā)揮著重要作用[38]，在對不同磷水平對接種根瘤菌紫花苜蓿生長特性的試驗中表明，接種根瘤菌并添加磷可促進苜蓿生長[39]。試驗中標記根瘤菌添加KH2PO4接種可增加苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)和根瘤等級，提高苜蓿的固氮能力，進而促進植株生長，提高苜蓿單株葉片數(shù)、株高、根長和生物量，其中，3436f添加50 mg/L KH2PO4接種苜蓿的處理效果最佳。

適宜濃度的KH2PO4對根瘤菌在苜蓿幼苗體內(nèi)運移及定殖、苜蓿結(jié)瘤和生長均有一定的促進作用。但須正確搭配菌株種類和KH2PO4濃度。試驗初步探索了KH2PO4對3株熒光標記根瘤菌在苜蓿幼苗體內(nèi)運移、定殖及對幼苗生長的影響，今后繼續(xù)探索KH2PO4對根瘤菌在田間苜蓿生殖生長階段體內(nèi)運移及定殖的影響，為確定利于根瘤菌在苜蓿體內(nèi)運移及定殖的外源物質(zhì)提供依據(jù)。

4 結(jié)論

KH2PO4可作為一種外源物質(zhì)添加于根瘤菌液中，促進根瘤菌侵染結(jié)瘤，提高苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤等級，促進根瘤菌侵入苜蓿體內(nèi)并刺激運移和定殖，其中，50 mg/L KH2PO4促使3436f長期穩(wěn)定的大量定殖于苜蓿根系，并快速運移至莖和上部葉中；50 mg/L KH2PO4促使12531f大量定殖于根系，并可運移至上部莖；200 mg/L KH2PO4促使gn5f穩(wěn)定定殖于根系和莖內(nèi)。根瘤菌添加KH2PO4接種也可促進苜蓿生長，增加葉片數(shù)、株高、根長和生物量。結(jié)合根瘤菌運移、定殖與幼苗生長狀況，篩選出標記根瘤菌株與KH2PO4濃度的最優(yōu)組合為3436f+50 mg/L，12531f+50 mg/L和gn5f+200 mg/L KH2PO4。