李 倩，王玉祥，張 博

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

白三葉(Trifoliumrepens)是我國大面積種植的富含蛋白質(zhì)，營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)牧草。白三葉草姿美、色翠綠、綠色期長，也是草坪草的骨干草種之一[1]。新疆野生白三葉是優(yōu)良的牧草資源，具有抗病耐熱、抗寒、耐旱且耐鹽堿等特點(diǎn)[2]。白三葉不僅具有生長范圍廣、易于種植、便于管理等優(yōu)點(diǎn)，而且有優(yōu)越的固氮性能，使其對草地畜牧業(yè)的發(fā)展和維持草地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定都具有重要作用。

由于城鎮(zhèn)現(xiàn)代化的快速發(fā)展，大量的開發(fā)和開采土地，導(dǎo)致地表植被無表土層保護(hù)，直接暴露于光照下，使其蒸發(fā)加強(qiáng)，溫度變化劇烈。持續(xù)低溫會使植物發(fā)生凍害，嚴(yán)重時甚至死亡。低溫?fù)p傷是影響植物生產(chǎn)的主要原因之一，因此，探索植物抗寒性的生理機(jī)制在基礎(chǔ)理論和實(shí)際生產(chǎn)上具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系經(jīng)過10多年的栽培馴化，從新疆北疆地區(qū)20多個縣市的野生白三葉種質(zhì)材料中選育出綜合性能較好的多個白三葉新種質(zhì)。為了進(jìn)一步探尋白三葉在自然降溫條件下生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，試驗(yàn)以選育的4個新種質(zhì)A、B、C、D為材料，以海法(Trifoliumrepenscv.haifa，E)作為對照，在秋季自然降溫過程中取樣觀測葉片相對含水量、葉綠素、丙二醛、游離脯氨酸、可溶性糖的含量和膜質(zhì)透性等指標(biāo)的變化，探尋自然降溫對白三葉生長發(fā)育的影響，為進(jìn)一步開展白三葉新種質(zhì)的抗寒性研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在新疆烏魯木齊市三坪農(nóng)場草業(yè)試驗(yàn)站，該站屬中溫帶大陸性半干旱氣候，光照資源豐富，月平均氣溫24.5℃，年降水量180 mm，年平均蒸發(fā)量1 780 mm，年均日照時數(shù)2 900 h，年均大于10℃的積溫3 500℃，無霜期為170～180 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以白三葉烏市南山(A)和(B)、昌吉(C)、呼圖壁(D)為供試材料，海法為對照(E)，海法為國外引進(jìn)品種(表1)。2014年3月采用營養(yǎng)體移栽方式從呼圖壁草地生態(tài)站野生資源圃移栽到新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪農(nóng)場草業(yè)試驗(yàn)站，每個種質(zhì)3個小區(qū)，小區(qū)面積3 m×5 m，行距30 cm，株距10 cm，深度3 cm。

試驗(yàn)于2015年8月17日開始取樣，9月26日結(jié)束，每隔10 d取樣1次，共取樣5次，取各植株展開的成熟葉片的中葉，3個小區(qū)進(jìn)行混合取樣，重復(fù)3次，同時記錄取樣前3 d的平均溫度。取樣期間，田間溫度呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，取樣前3 d的平均溫度依次是28.0℃(T1，8月17日)、16.5℃(T2，8月27日)、13.0℃(T3，9月6日)、9.0℃(T4，9月16日)、6.5℃(T5，9月26日)。每次取完的樣品立即放入液氮中保存，用以生理指標(biāo)的測定。

表1 參試材料信息

1.3 測量內(nèi)容與方法

采用烘干法測量白三葉頂部葉片的相對含水量[3]、采用SPAD-502測定葉綠素含量、硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量[4]、蒽酮比色法測定可溶性糖[5]、磺基水楊酸-酸性茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量[6]、電導(dǎo)率法測定膜質(zhì)透性[3]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0和Excel 2010軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降溫對葉片含水量的影響

自然降溫對白三葉葉片的相對含水量影響較大，隨著自然溫度的逐漸降低，5個品種的葉片含水量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。其中，當(dāng)溫度從28.0℃逐漸降低到16.5℃時，5個白三葉的葉片含水量均有升高，在整個自然降溫過程中，D、E的葉片含水量在6.5℃時比9℃時高，種質(zhì)B在16.5℃葉片含水量較高，達(dá)到83.41%。種質(zhì)A在28.0℃下降到13.0℃過程中，葉片含水量變化不大(P<0.05),但溫度降到9℃和6.5℃時，與其他處理差異顯著(P<0.05)。白三葉葉片含水量在溫度16.5℃時高于其他(高溫和低溫)處理(表2)。

表2 自然降溫下白三葉葉片的含水量

注：不同字母表示同一種質(zhì)各溫度變化差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 降溫對葉綠素含量的影響

自然降溫對5個白三葉的葉綠素含量均有影響，隨著溫度的降低，其變化趨勢一致。其中，A和B呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢；C、D和對照E的變化晚于A、B 10 d，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢；種質(zhì)不同葉綠素含量變化幅度不同。A，B，C和D的葉綠色含量在溫度從13.0℃降低到9.0℃的過程中變化幅度均較大，而E在此溫度下變化不明顯，但是E在8月17～8月27日，溫度從9.0℃降低到6.5℃時葉綠素含量突然下降，相比在16.5℃時候葉綠素含量下降29.30%，說明低于9.0℃可能使E失綠，相對其他種質(zhì)來說，對照E對溫度的下降比較敏感。通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析表明，種質(zhì)A，B和C在溫度從13.0℃下降到9.0℃時，葉綠素含量下降幅度最大，下降比例分別為13.10%，17.20%和19.01%，5個種質(zhì)整個降溫過程葉綠素的變化幅度分別為26.36%、30.01%、27.36%、26.89%、29.26%。所有種質(zhì)在溫度為16.5℃時，葉綠素含量最高(表3)，說明溫度在16.5℃時，有利于白三葉生長以及葉綠素的積累。種質(zhì)A、B的葉綠素含量普遍高于其他種質(zhì)。

2.3 降溫對丙二醛含量的影響

MDA是植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的一種膜脂過氧化物，其含量的多少可以反應(yīng)出膜脂過氧化物的大小，即受損害程度的大小[7-10]。低溫脅迫，破壞了細(xì)胞膜，使細(xì)胞通透性增加造成物質(zhì)流失。隨著溫度的降低，各種質(zhì)的丙二醛含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，在5個溫度變化下，D、E種質(zhì)的變化趨勢大于其他3個種質(zhì)，2個種質(zhì)在溫度從16.5℃降低到13.0℃時，丙二醛含量快速升高；種質(zhì)E在溫度降低到6.5℃時又有一個快速變化點(diǎn)，說明種質(zhì)E對溫度變化比較敏感。當(dāng)溫度從28.0℃下降到6.5℃，各種質(zhì)的變化幅度分別是56.81%、56.33%、56.86%、62.02%、65.24%。對照種質(zhì)E的丙二醛含量相比種質(zhì)A高2～3倍，說明對照組E的受傷害程度較大。A，B和C的MDA含量較低，變化幅度較小，說明葉片在溫度變化時，對溫度感應(yīng)較敏感，生物膜受到的破壞在自身承受范圍內(nèi)，損害程度較小(表4)。

表3 自然降溫下白三葉葉片的葉綠素含量

2.4 降溫對可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物的主要滲透調(diào)節(jié)劑，也是合成其他有機(jī)溶劑的碳架和能量來源，對細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體起穩(wěn)定作用。低溫脅迫通過影響增加細(xì)胞膜的通透性，使電解質(zhì)外滲，營養(yǎng)物質(zhì)流失，從而使可溶性糖含量相應(yīng)增加。同一種質(zhì)在自然降溫過程中，可溶性糖含量顯著上升，試驗(yàn)在5個溫度處理下，各種質(zhì)的變化幅度分別是61.71%、60.24%、50.02%、56.03%、58.01%，A、B的變化幅度較大，可溶性糖含量也相對其他種質(zhì)較高，A的可溶性糖含量比對照E高出大約一倍(表5)。

表4 自然降溫對三葉葉片的丙二醛含量的影響

表5 自然降溫下白三葉葉片的可溶性糖含量

2.5 降溫對游離脯氨酸含量的影響

游離脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫條件下,許多植物體內(nèi)脯氨酸大量積累。積累的脯氨酸除了作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外,還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等方面起重要作用。試驗(yàn)中，在自然降溫條件下，植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。脯氨酸對低溫的反應(yīng)常隨著低溫程度的不同而異，在較低的長期低溫下，脯氨酸的增加是植物傷害的結(jié)果，而在無嚴(yán)重冷害的鍛煉溫度下，脯氨酸的積累則是一種適應(yīng)性反應(yīng)。5個種質(zhì)隨著溫度降低，游離脯氨酸含量均逐漸增加。溫度從16.5℃下降到13.0℃時，游離脯氨酸變化幅度最大。在28.0℃和16.5℃時，A的游離脯氨酸含量相比對照組高了2倍；在13.0，9.0和6.5℃，A的游離脯氨酸含量高出對照組E約4倍。在5個溫度處理下，各種質(zhì)的游離脯氨酸含量總體表現(xiàn)為A>B>C>D>E，變化幅度分別為83.87%、74.97%、78.04、75.75%、71.32%。在9月初自然降溫過程中，低溫脅迫進(jìn)一步加大，葉片中的游離脯氨酸含量急劇增加(表6)。

表6 自然降溫下白三葉的游離脯氨酸含量

2.6 降溫對電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞膜是活細(xì)胞與環(huán)境之間的界面與屏障，各種不良環(huán)境對植物的影響首先作用于細(xì)胞膜，改變其透性，細(xì)胞膜透性大小反映出細(xì)胞質(zhì)膜受害程度。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂和膜透性的變化是逆境脅迫作用的關(guān)鍵所在[11]。電導(dǎo)率越大，細(xì)胞膜透性越大，植物抗寒能力就越小[12]。

同一種質(zhì)在不同溫度下的電導(dǎo)率呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢,不同溫度下各個種質(zhì)的變化幅度各不相同，5個不同溫度處理下，電導(dǎo)率變化幅度依次為30.06%、28.13%、29.57%、33.57%、39.52%。B的電導(dǎo)率變化最小，說明植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)流失較少，細(xì)胞對溫度的脅迫的破壞抵御能力較好，使膜脂透性減小(表7)。

表7 自然降溫下白三葉的電導(dǎo)率

3 討論

在自然降溫過程中，白三葉各項(xiàng)生理指標(biāo)發(fā)生顯著變化。5份白三葉種質(zhì)的葉片相對含水量在逆境脅迫下呈現(xiàn)降低的趨勢，這與李亞萍等[13]的研究結(jié)果類似。研究表明，不同材料對生理指標(biāo)的響應(yīng)不同，呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律[14]，與研究不同品系的生理指標(biāo)變化幅度也不同，抗寒性較強(qiáng)的品種下降趨勢較緩慢的結(jié)果相一致。低溫使葉片含水量降低[15]，減少細(xì)胞內(nèi)外結(jié)冰，以增加其抗寒性[16]。由此說明，當(dāng)溫度持續(xù)降低時，抗寒性種質(zhì)的保水能力較強(qiáng)，水分損失較少。

增加可溶性糖含量可提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，增加胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，增強(qiáng)植物抗凍能力。秦文斌等[17]在甘藍(lán)中研究表明，低溫處理下，隨著處理時間的延長 4種甘藍(lán)的可溶性糖含量均有所增加,且耐寒品種的增加幅度較大[17]，與研究結(jié)果一致。對白三葉抗寒性的研究表明，當(dāng)自然溫度降至8～2℃時，白三葉的可溶性糖含量出現(xiàn)不同程度的下降，隨著溫度的逐漸降低，白三葉可溶性糖含量出現(xiàn)升降交替的變化[18]。試驗(yàn)只研究了自然降溫過程中28.0～6.5℃的5個梯度，并沒有研究0℃以下的可溶性糖含量，在持續(xù)低溫脅迫下，白三葉可溶性糖含量的變化規(guī)律有待進(jìn)一步探究。

植物凍害與膜脂過氧化緊密相關(guān)，MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，MDA與蛋白質(zhì)結(jié)合后對質(zhì)膜有毒害作用，MDA的含量一定程度上反映了耐寒性的強(qiáng)弱[19]。游離脯氨酸是植物耐寒性強(qiáng)弱的重要生理指標(biāo)之一，也是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的增加有利于細(xì)胞持水和生物大分子的穩(wěn)定。在發(fā)生低溫、干旱、鹽漬等非生物脅迫時,大部分植物均會積累大量的脯氨酸[20],來保持細(xì)胞持水和生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,適應(yīng)逆境。朱麗芳等[21]報道脯氨酸是植物逆境脅迫的產(chǎn)物，逆境環(huán)境會引起植物體內(nèi)脯氨酸含量增加,這與此次研究結(jié)果一致。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在溫度降低至13.0℃時，丙二醛、可溶性糖、游離脯氨酸含量均顯著增加，其中，電導(dǎo)率的變化趨勢是先減少后增加，表明體內(nèi)細(xì)胞受到較為嚴(yán)重的破壞，這與高婷婷[22]研究結(jié)果一致，隨著溫度的降低，其膜脂過氧化程度逐漸增加、細(xì)胞或組織大量脫水、細(xì)胞質(zhì)膜透性增大[23]，電解質(zhì)外滲，白三葉受溫度變化的危害程度逐漸增大[24]，但是未超過白三葉自身調(diào)節(jié)范圍。

4 結(jié)論

隨著自然溫度的降低，葉片含水量逐漸降低，種質(zhì)A的葉片含水量變幅最大，下降幅度為11.23%；在16.5℃各種質(zhì)的葉片含水量均達(dá)到最大值。葉片葉綠素含量變化呈降低趨勢，且種質(zhì)C、D和對照E的葉綠素變化晚于A、B種質(zhì)10 d；整個降溫過程中，丙二醛、可溶性糖和游離脯氨酸含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，但對照E的丙二醛含量相比種質(zhì)A高出2～3倍，D在6.5℃時丙二醛含量達(dá)到最大，為29.02 μmol/g；A的可溶性糖含量比對照E高出大約1倍，A的可溶性糖含量在6.5℃時最高，達(dá)到40.42 μg/g；A的游離脯氨酸含量比對照組高出2～4倍，A的游離脯氨酸在6.5℃最高，為189.23 μg/g，而E的游離脯氨酸在28℃時最小，僅有11.61 μg/g；電導(dǎo)率則呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢，在16.5℃時5個白三葉種質(zhì)的電導(dǎo)率均最低，A電導(dǎo)率在16.5℃時低至22.83%。綜合分析得出，在5個白三葉種質(zhì)中，A、B對降溫的耐受性優(yōu)于其他種質(zhì)。