陶 茸，尹國麗，師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美 草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

苜蓿(Medicagosativa)做為優(yōu)質(zhì)多年生豆科牧草，具有一次種植、多年收獲、產(chǎn)草量高、營養(yǎng)豐富、適口性好等特點，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料的重要來源，有“牧草之王”的美稱。但種植過苜蓿的土壤很難重茬種植[1]?；凶饔?allelopathy) 是植物將其在代謝活動中所產(chǎn)生的化感物質(zhì)，通過莖葉揮發(fā)、莖葉淋溶、根系分泌以及植物殘株的腐敗降解等途徑釋放到環(huán)境中，進而對周圍其他植物或微生物造成有利或不利的影響[2]。酚酸是一類重要的化感物質(zhì)，由于其相對分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因不易降解而累積在土壤中，進而影響作物生長，是引起苜蓿連作障礙的一類主要化合物[3-6]。Abdul 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿根系和殘茬能夠分泌酚酸類物質(zhì)，如咖啡酸、綠原酸、香豆酸、羥基苯甲酸和阿魏酸。也有研究表明，苜蓿的自毒物質(zhì)主要是香豆素、綠原酸、水楊酸等酚類物質(zhì)和皂甙兩大類[8]。

近幾年，主要對紫花苜蓿生長部位及殘茬的浸提液對紫花苜蓿自毒效應(yīng)及對雜草、作物、土壤等化感作用方面進行了研究[9-12]。通過研究外源酚酸對萵苣幼苗、人參種子萌發(fā)和三七、小麥的化感作用，揭示了酚酸類物質(zhì)對部分植物生長發(fā)育的影響[6,13-14]，但紫花苜蓿中的主要酚酸類物質(zhì)—對羥基苯甲酸、綠原酸、香豆素、阿魏酸和咖啡酸對其種子萌發(fā)及幼苗生長的影響系統(tǒng)報道較少。試驗以紫花苜蓿為受體材料，評價對羥基苯甲酸、綠原酸、香豆素等5種酚酸類化合物對其種子萌發(fā)及幼苗的化感作用，初步篩選出對苜?；幸种谱饔幂^強的酚酸類物質(zhì)，以期為酚酸類化合物對紫花苜蓿的化感作用機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的甘農(nóng)9號紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.9)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室提供。

藥劑為(A)對羥基苯甲酸、(B)綠原酸、(C)香豆素、(D)阿魏酸、(E)咖啡酸均為分析純品，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

稱取(A)對羥基苯甲酸、(B)綠原酸、(C)香豆素、(D)阿魏酸、(E)咖啡酸各1 g分別溶于4 mL無水乙醇中，定容至1 L，配制成1.00 mg/mL 母液，放入4℃冰箱備用(分別以A、B、C、D、E表示)。將母液稀釋至500、50、5、0.5 mg/L的溶液(分別以A4、A3、A2、A1；B4、B3、B2、B1；C4…E1表示，表1)，采用玻璃培養(yǎng)皿法。在直徑9 cm 的玻璃培養(yǎng)皿底部鋪兩層滅菌濾紙，分別均勻擺放滅菌(用75%酒精消毒3～5 min 后再用蒸餾水沖洗種子4～6次)處理的苜蓿種子30粒，加入5 mL不同濃度的酚酸溶液(500、50、5、0.5 mg/L)，每個處理重復(fù)3次，置于光周期25℃、12 h，暗周期20℃、12 h的人工氣候箱中發(fā)芽。種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)為胚根突破種皮1～2 mm[15-17]，每兩天補充相應(yīng)的酚酸溶液，對照添加蒸餾水2 mL，每天定時記錄發(fā)芽種子數(shù)。第7 d統(tǒng)計苜蓿的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(經(jīng)預(yù)試驗，在該試驗條件下，培養(yǎng)3 d時苜蓿達(dá)到發(fā)芽高峰期，培養(yǎng)至4 d后不再萌發(fā)，故采用培養(yǎng)3 d的數(shù)據(jù)測定其發(fā)芽勢)、胚根長和胚軸長。5 d 后切取主根根端1 cm根段，在ZEISS Observer D1體式顯微鏡下，Axio Cam MRC5型顯微數(shù)碼攝影儀系統(tǒng)10倍放大視野下觀察苜蓿根毛形態(tài)并拍照，用顯微測量軟件測量根毛長度。每組處理測量5個根段，每根段上測量10根根毛，計算根毛的平均長度，重復(fù)3 次[18]。

表1 外源酚酸處理濃度梯度

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

發(fā)芽率(GR，%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽勢(GP，%)=發(fā)芽初期(3d)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

苜蓿種子簡易活力指數(shù)(SVI，%)=發(fā)芽率×幼苗長度×100%

化感效應(yīng)指數(shù)(RI)=(T-C)/T(T≥C)或RI=(T-C)/C(T

式中：C為對照值，T為處理值。當(dāng)RI≥0時，為促進作用；當(dāng)RI≤0時，為抑制作用，RI絕對值的大小表示化感作用強度。利用化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)表示化感自毒作用的綜合效應(yīng)，SE 是供體對同一受體多個測試項目的化感效應(yīng)敏感指數(shù)RI的算術(shù)平均值[19-20]。

數(shù)據(jù)采用GENSTAT 12.1 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用GNOVA方法進行多重比較。用Office 2010應(yīng)用軟件處理數(shù)據(jù)，并制作圖表[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源酚酸對苜蓿種子活力和根毛發(fā)育的影響

不同處理之間，苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和種子簡易活力均差異性顯著(P<0.05)。5種酚酸對苜蓿種子簡易活力指數(shù)作用呈現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的效應(yīng)，在苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的指標(biāo)中，對羥基苯甲酸、綠原酸和香豆素處理表現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制。其中香豆素處理的低促高抑現(xiàn)象最為明顯，當(dāng)其濃度為0.5 mg/L時，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別為96.67%、95.56%，比對照分別高3.34%、4.45%，隨著香豆素處理劑量的增加，苜蓿種子的各項指標(biāo)均呈下降趨勢，當(dāng)濃度增大至500 mg/L，種子基本不萌發(fā)，表面發(fā)黑、腐爛嚴(yán)重，表明C處理對苜蓿種子萌發(fā)具有較強的抑制作用，且抑制效應(yīng)隨處理濃度的升高而顯著增強。咖啡酸對苜蓿種子活力的影響與香豆素相似，也表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)，但抑制幅度較為平緩，添加5 mg/L劑量的咖啡酸，苜蓿種子的發(fā)芽率和簡易活力指數(shù)均達(dá)到最大，分別為93.33%和824.89%，低于或高于此濃度均表現(xiàn)出抑制現(xiàn)象。

根毛是植物體吸收水分和養(yǎng)分的主要部位，同時也是根環(huán)境脅迫信號傳遞的起始部位，其在逆境下的形態(tài)、特征和表現(xiàn)是植物根系有效吸收和利用土壤水分及養(yǎng)分的直接適應(yīng)特征[18]。結(jié)果表明，不同處理之間，苜蓿根毛生長均差異性顯著(P<0.05)，咖啡酸處理對苜蓿根毛生長明顯受抑，0.5 mg/L(低劑量)處理時根毛短且細(xì)，同時出現(xiàn)彎曲、纏結(jié)等現(xiàn)象(圖1-B)，隨著處理濃度的增加，該現(xiàn)象更為明顯，在500 mg/L(高劑量)處理時，苜蓿根腐爛嚴(yán)重，根毛幾乎未發(fā)育(圖1-C)。對羥基苯甲酸、香豆素、阿魏酸處理對苜蓿根毛生長均呈現(xiàn)低濃度促進、高濃度抑制的效應(yīng)，其中香豆素處理表現(xiàn)尤為明顯，當(dāng)其處理濃度低于5 mg/L時，根毛長度最長，達(dá)到729.33 μm，明顯促進苜蓿根毛的生長發(fā)育，不僅數(shù)量有所增加，且長度增長，直徑增大；高于5 mg/L時明顯抑制根毛生長，數(shù)量少，長度短，且呈絲狀，纏結(jié)現(xiàn)象嚴(yán)重。綜上，5種酚酸處理對根毛生長發(fā)育的抑制效應(yīng)從強到弱依次為咖啡酸、阿魏酸、香豆素、綠原酸、對羥基苯甲酸(表2)。

表2 外源酚酸處理下苜蓿種子的活力及根毛發(fā)育

注：s.e.m為平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤，**P<0.01，ns表示不顯著，下同

圖1 外源酚酸處理下苜蓿根毛的發(fā)育Fig.1 The effects of exogenous phenolic acid on the root hair development of alfalfa 注：A.發(fā)育正常的根毛；B.纏結(jié)嚴(yán)重的根毛；C.根毛幾乎未發(fā)育

2.2 酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子胚根生長的影響

不同處理之間，苜蓿種子胚根的生長均差異顯著(P<0.05)，同種酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子胚根生長的化感作用強度與濃度有密切的關(guān)系，其中香豆素處理呈現(xiàn)出明顯的高濃度抑制趨勢。高于0.5 mg/L的香豆素處理，苜蓿種子胚根長度呈現(xiàn)急劇下降趨勢，其處理濃度增至500 mg/L時，胚根幾乎沒有萌發(fā)，長度為0。50 mg/L的對羥基苯甲酸處理明顯促進了苜蓿胚根生長，長度最長。高于50 mg/L的對羥基苯甲酸、咖啡酸和阿魏酸處理與對照相比明顯抑制苜蓿種子胚根的生長，胚根長度明顯降低(圖2)。綜上，香豆素處理對苜蓿胚根生長的抑制效應(yīng)最強，其次是阿魏酸處理，對羥基苯甲酸處理最弱。

圖2 外源酚酸處理下紫花苜蓿的胚根長Fig.2 The effects of exogenous phenolic acid on hypocotyl growth of alfalfa

2.3 酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子胚軸生長的影響

不同處理之間，苜蓿種子胚軸的生長均差異顯著(P<0.05)，5 mg/L和50 mg/L綠原酸處理的苜蓿胚軸長度高于對照，其余酚酸類物質(zhì)處理對紫花苜蓿胚軸生長的影響主要表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，高濃度抑制作用更明顯。0.5 mg/L處理下，咖啡酸對苜蓿胚軸生長的抑制效應(yīng)最強，其余處理基本一致。處理濃度高于50 mg/L時，香豆素、阿魏酸和咖啡酸處理的苜蓿種子胚軸長度急劇降低，處理濃度增至500 mg/L時，香豆素處理的種子未萌發(fā)，胚軸長度為0。對羥基苯甲酸處理對苜蓿種子胚軸生長的影響效應(yīng)較弱(圖3)。

圖3 外源酚酸處理下紫花苜蓿種子的胚軸長Fig.3 The effects of exogenous phenolic acid on radicle growth of alfalfa

2.4 酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子萌發(fā)的化感綜合效應(yīng)

5種酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子萌發(fā)的化感綜合效應(yīng)總體表現(xiàn)為抑制，香豆素處理的化感綜合效應(yīng)SE值為-0.356，抑制效應(yīng)最強，其次是咖啡酸處理，對羥基苯甲酸抑制效應(yīng)最弱。除根毛長度外，香豆素處理對苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、種子簡易活力和胚軸、胚根長度抑制作用均最強，咖啡酸對苜蓿種子根毛生長抑制作用最強，化感綜合效應(yīng)達(dá)-0.587；對羥基苯甲酸處理對苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和種子簡易活力在一定程度上呈現(xiàn)促進作用，阿魏酸對苜蓿種子胚軸長度和簡易活力在一定程度上呈現(xiàn)促進作用。各酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子萌發(fā)化感抑制效應(yīng)從強至弱依次為：香豆素、咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、對羥基苯甲酸(表3)。

表3 酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子萌發(fā)的化感效應(yīng)指數(shù)

3 討論

化感物質(zhì)的處理濃度不同，對受體發(fā)芽的抑制作用不同[7]，研究表明，酚酸類化感物質(zhì)能夠影響植物生長，是引起農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中連作障礙的主要因素之一[5-6]。選取了苜蓿中的主要5種酚酸類物質(zhì)為試驗處理，證實了這些酚酸類化合物對苜蓿種子的生長均具有化感自毒作用，其化感作用總體表現(xiàn)為抑制的趨勢。白麗榮等[4]研究了紫花苜蓿提取液顯著抑制黃頂菊種子的萌發(fā)和幼苗的發(fā)育，濃度越高其化感抑制作用越強；王希等[12]研究了苜蓿水浸液對芽長和根長的抑制作用大于對發(fā)芽率的抑制作用，與本研究的對羥基苯甲酸、香豆素、阿魏酸和咖啡酸處理結(jié)果一致。另外試驗明確了香豆素處理對苜蓿種子萌發(fā)具有較強的抑制作用，而對羥基苯甲酸對苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用較弱，這與趙瑞林[10]研究的對羥基苯甲酸對苜蓿種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，與對照差異顯著等結(jié)果不同，可能是由于本實驗材料及處理濃度不同所導(dǎo)致。

根毛對外界環(huán)境中影響因子的響應(yīng)十分敏感，化感物質(zhì)同樣也會影響到植物根毛的生長，如黃花蒿(Artemisiaannua)水浸提液對小麥根毛的生長具有抑制[22]，土荊芥揮發(fā)油對玉米根毛發(fā)育有顯著的抑制[19]。試驗中咖啡酸處理明顯抑制苜蓿根毛的生長，該處理苜蓿根毛短且細(xì)，彎曲、纏結(jié)現(xiàn)象嚴(yán)重，隨著處理濃度的增加，苜蓿根不能正常生長，腐爛嚴(yán)重，根毛幾乎完全消失，與對照呈顯著差異，5組處理對根毛長度的抑制效應(yīng)強弱順序依次是E>D>C>B>A，即咖啡酸對苜蓿根毛生長的化感抑制作用最強。研究發(fā)現(xiàn)，不同酚酸類物質(zhì)對苜蓿胚根和胚軸的生長存在差異，香豆素處理對苜蓿胚根生長的抑制作用最強，其次是阿魏酸，對羥基苯甲酸最弱，綠原酸對苜蓿種子胚軸生長有一定程度的促進作用，其余4種酚酸對其有不同程度的抑制作用。而且不同濃度下各酚酸類物質(zhì)的化感效應(yīng)指數(shù)的強度順序也存在差異，這可能是不同酚酸類物質(zhì)在苜蓿細(xì)胞中的作用機理存在差異或是苜蓿在不同酚酸類物質(zhì)的作用下產(chǎn)生其他次生物質(zhì)所致。萵苣幼苗在高濃度酚酸的脅迫下，其體內(nèi)活性氧大量積累，高濃度的活性氧對萵苣幼苗細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等具有顯著的破壞作用，進而導(dǎo)致細(xì)胞活力降低甚至凋亡，最終抑制植物生長[6]。苯甲酸、對羥基苯甲酸和水楊酸對煙苗根系發(fā)育、光合作用有抑制作用[23]。苯甲酸和肉桂酸的施用打破了番茄根部保護酶系統(tǒng)原有的平衡，造成了根系的膜質(zhì)過氧化[24]。

4 結(jié)論

在0～500 mg/L的濃度處理范圍內(nèi)，隨著5種外源酚酸處理濃度的不斷增加，對苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制作用不斷增強。其中香豆素和咖啡酸處理對苜蓿種子萌發(fā)的化感綜合效應(yīng)指數(shù)分別為-0.356和-0.240，具有較強的抑制作用，高于50 mg/L的香豆素與咖啡酸處理和500 mg/L的阿魏酸顯著抑制苜蓿種子萌發(fā)。對羥基苯甲酸對苜蓿種子萌發(fā)的化感綜合效應(yīng)指數(shù)為-0.026，與其他4種酚酸相比抑制作用最弱。5種酚酸類物質(zhì)對苜蓿種子萌發(fā)的化感抑制效應(yīng)強弱順序為：香豆素>咖啡酸>阿魏酸>綠原酸>對羥基苯甲酸。筆者僅從不同濃度的5種酚酸處理對苜蓿種子萌發(fā)的各項指標(biāo)呈現(xiàn)出的不同受抑規(guī)律進行研究，他們對苜蓿的其他作用潛力及化感自毒作用機理還有待進一步深入研究，以便為消除苜蓿連作障礙提供新思路。