許興澤，趙桂琴，王 軍，柴繼寬，茍智強(qiáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè) 可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

燕麥屬(Avena)植物均為一年生草本，適應(yīng)性較強(qiáng)，在世界各地均有分布，按細(xì)胞遺傳基礎(chǔ)及特點(diǎn)，分為二倍體、四倍體和六倍體3大類(lèi)，共30種[1-2]。目前，栽培利用最為廣泛的是六倍體普通燕麥[2]，既可作為糧食作物收獲籽粒，又可作為飼料作物生產(chǎn)飼草[3]。

染色體核型分析作為研究細(xì)胞遺傳的重要手段，是植物種質(zhì)資源研究的主要內(nèi)容，研究包括染色體結(jié)構(gòu)、染色體形態(tài)與染色體功能之間的相互關(guān)系[4]。觀察燕麥根尖細(xì)胞染色體，可作為對(duì)其分類(lèi)的重要依據(jù)，包含數(shù)目和形態(tài)等，也可為燕麥的進(jìn)化研究提供理論依據(jù)[5-6]。大多數(shù)植物染色體在臂比、著絲點(diǎn)位置等，會(huì)伴隨著植物倍性化后存在明顯差異，與此同時(shí)，依據(jù)各個(gè)核型參數(shù)形成的核型公式，也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的改變。染色體數(shù)目、大小、形態(tài)等，可通過(guò)核型及核型模式圖進(jìn)行直觀鑒定，而對(duì)于細(xì)胞核型參數(shù)，如染色體類(lèi)型、體長(zhǎng)度、臂比值等需要根據(jù)染色體的觀察結(jié)果進(jìn)行推算。染色體著絲粒的位置以及隨體的有無(wú)等都是染色體組在有絲分裂中期可以被測(cè)定的表型特征，是確定核型的組成成分[7-8]。梁國(guó)玲等[9]通過(guò)比較分析燕麥雜交新品系I-D與其親本在染色體形態(tài)特征和核型上的差異，得出燕麥I-D品系具有雙親染色體的一些特有形態(tài)，其中部著絲點(diǎn)染色體所占比例28.57%，核不對(duì)稱(chēng)系表相較于親本是更為進(jìn)化的種群。蔡華等[10]對(duì)一種野生燕麥的核型進(jìn)行了分析，表明其物種染色體數(shù)為2n=42，染色體臂比為2.34，核型公式為2n=6x=42=22m+20sm(2SAT)，核型類(lèi)型為比較對(duì)稱(chēng)的2B型。劉偉[11]分析了燕麥不同倍性材料的核型并構(gòu)建了SSR指紋圖譜，得出國(guó)外裸燕麥品種核型公式為2n=6x=42=24m+18sm(2SAT)，發(fā)現(xiàn)染色體的核型類(lèi)型隨著倍性的增加由2A型變?yōu)檩^不對(duì)稱(chēng)的2B型，不對(duì)稱(chēng)性隨著倍性的增加逐漸增大，認(rèn)為燕麥染色體的倍性水平越高，往往越容易發(fā)生進(jìn)化，證明燕麥染色體多倍化是進(jìn)化的趨勢(shì)。耿帆等[12]認(rèn)為生長(zhǎng)在不同生態(tài)環(huán)境下的裸燕麥，其核型具有一定的差異性。Fominaya A等[13]鑒定了二倍體和四倍體燕麥的各對(duì)染色體，通過(guò)染色體C-分帶方法對(duì)二倍體燕麥和四倍體燕麥進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在顯帶分析中所有C組染色體均較A組染色體的染色深。截止目前，對(duì)燕麥二倍體、四倍體和六倍體染色體核型同時(shí)進(jìn)行研究和分析的報(bào)道不多。因此，試驗(yàn)擬通過(guò)染色體數(shù)目、大小及形態(tài)等表型，分析其核型特征，探究二倍體、四倍體和六倍體燕麥之間的核型差異。

1 材料和方法

試驗(yàn)材料為燕麥屬3個(gè)種Avenanudibreri,A.hispanica和A.sativa，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.1 染色體制片方法

將粒大飽滿的燕麥種子先用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min進(jìn)行消毒處理，無(wú)菌水清洗2～3次,置入25℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)。將露白的種子放入4℃冰箱中48 h，之后在25℃光照恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)萌發(fā)。待根長(zhǎng)至1.0～2.0 cm 時(shí)，剪取新生粗壯根尖于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中預(yù)處理3 h，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1，V/V)中在4℃下固定24 h，然后用1 mol/L鹽酸在60℃下解離10 min，最后用改良苯酚品紅染液染色2 h，進(jìn)行常規(guī)壓片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2 染色體核型分析

采用文獻(xiàn)[14]的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)30個(gè)分散較好的有絲分裂中期細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，若85%以上的細(xì)胞都具有恒定一致的染色體數(shù)，即認(rèn)為是該植物染色體數(shù)目。3份燕麥材料均選取5個(gè)分散良好、形態(tài)清晰的中期分裂相照片，利用Photoshop軟件根據(jù)染色體形態(tài)特征先進(jìn)行染色體初步配對(duì)，然后分別測(cè)量各條染色體的長(zhǎng)臂和短臂長(zhǎng)度，利用Excel軟件對(duì)測(cè)得的核型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并依據(jù)各條染色體的總長(zhǎng)度和臂比對(duì)初步配對(duì)的染色體進(jìn)行調(diào)整，得到最佳的同源染色體配對(duì)。按染色體相對(duì)長(zhǎng)度由長(zhǎng)至短依次排列；若長(zhǎng)度相同，則短臂長(zhǎng)者在前；排列時(shí)短臂在上，長(zhǎng)臂在下，著絲粒對(duì)齊排列于同一直線上，成一張完整的染色體核型圖。

(1)染色體長(zhǎng)度

①絕對(duì)長(zhǎng)度(或?qū)嶋H長(zhǎng)度)：均以微米表示。

②相對(duì)長(zhǎng)度：均以百分比表示，根據(jù)Levan等[15]的公式計(jì)算。

③染色體長(zhǎng)度比：核型中最長(zhǎng)染色體與最短染色體的比值。

(2) 次縊痕及隨體

次縊痕的有無(wú)及位置，隨體的有無(wú)、形狀和大小都是重要的形態(tài)指標(biāo)，帶隨體的染色體用SAT或*標(biāo)記。

(3) 臂比值

著絲點(diǎn)的位置精確到0.01。

根據(jù)臂比值可確定著絲點(diǎn)的位置(表 1)，進(jìn)而可將染色體分成相應(yīng)的類(lèi)型[16]。

表1 著絲點(diǎn)位置命名

(4)核型的分類(lèi)

依據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行，用染色體的長(zhǎng)度比與臂比兩個(gè)主要特征來(lái)進(jìn)行核型分類(lèi)，用于區(qū)分核型的對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)的程度(表2)。

表2 核型分類(lèi)

注：1A為最對(duì)稱(chēng)核型，4C為最不對(duì)稱(chēng)核型

(5)核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)(As.K)

反映染色體對(duì)稱(chēng)與否、進(jìn)化與否的一個(gè)參數(shù)。

核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)=長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)鏡檢觀察到的染色體圖像，利用Photoshop對(duì)染色體圖片進(jìn)行摳圖、配對(duì)數(shù)據(jù)分析，Microsoft Excel軟件作核型模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Avena nudibreri燕麥的核型特征

通過(guò)鏡檢觀察，選擇30個(gè)分散好的有絲分裂中期細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，其中85%以上細(xì)胞均具有恒定一致的14條染色體，為二倍體。根據(jù)各條染色體的長(zhǎng)臂和短臂長(zhǎng)度、總長(zhǎng)度和臂比值進(jìn)行配對(duì)，獲得供試材料的核型圖及核型模式(圖1)，以及主要核型參數(shù)(表3)。

圖1 Avenanudibrer的染色體照片、核型圖及核型模式Fig.1 Chromosomes shape,karyotype and karyotype pattern of Avena nudibrer

供試材料的7對(duì)染色體中，1號(hào)染色體相對(duì)長(zhǎng)度最長(zhǎng)，7號(hào)最短；臂比值以7號(hào)染色體最大，5號(hào)染色體次之，1號(hào)染色體最小。共有5對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體(m)和2對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體(sm)，其中第5對(duì)是帶有隨體的染色體，且屬于近中部染色體(sm)。核型公式為2n=2x=14=10m+4sm(2SAT)。染色體相對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍為5.26%～9.09%；染色體的長(zhǎng)度比為1.72。染色體臂比值大于2∶1的有2對(duì)，即第5號(hào)和第7號(hào)染色體，所占比例為28.57%。核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為57.85%，核型屬于較原始的2A型。

表3 Avena nudibrer燕麥染色體類(lèi)型參數(shù)

注：*為隨體染色體，隨體長(zhǎng)度未計(jì)算在內(nèi)

2.2 Avena hispanica燕麥的核型特征

Avenahispanica燕麥的染色體照片、核型及核型模式見(jiàn)圖2，主要核型參數(shù)(表4)。Avenahispanica共有28條染色體，是一個(gè)四倍體種；共有10對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體(m)、4對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體(sm)，其中第10對(duì)是帶有隨體的染色體。核型公式為2n=4x=28=20m+8sm(2SAT)。染色體相對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍為2.67%～5.03%；染色體的長(zhǎng)度比為1.88。染色體臂比值大于2∶1的有3對(duì)，所占百分比為21.42%。核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為60.04%，染色體組核型屬于2A型。

表4 Avena hispanica燕麥種染色體類(lèi)型參數(shù)

注：*為隨體染色體，隨體長(zhǎng)度未計(jì)算在內(nèi)，下表相同

圖2 Avena hispanica染色體、核型及核型模式Fig.2 Chromosomes shape,karyotype and karyotype pattern of A.hispanica

2.3 Avena sativa燕麥的核型特征

通過(guò)鏡檢觀察，Avenasativa共有42條染色體，為六倍體，其染色體照片、核型圖及核型模式見(jiàn)圖3，主要核型參數(shù)見(jiàn)表5。該供試材料含有15對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體(m)和8對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體(sm)，其中第12對(duì)和第17對(duì)是帶有隨體的染色體。核型公式為2n=6x=42=26m+16sm(4SAT)。染色體相對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍為3.12%～11.72%；染色體的長(zhǎng)度比(最長(zhǎng)與最短)為3.75。染色體臂比值大于2∶1的有6對(duì)，所占百分比為12/42×100%=28.57%。核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為61.01%，染色體組核型屬2B型。

2.4 不同倍性燕麥種核型比較

對(duì)3個(gè)供試材料進(jìn)行比較(表6)，發(fā)現(xiàn)不同倍性燕麥染色體的核型有所不同。由核型公式分析，二倍體、四倍體和六倍體均含有m型和sm型染色體，且隨著倍性的增加，具m型和sm型染色體的數(shù)目呈逐漸

圖3 Avena sativa燕麥染色體、核型及核型模式Fig.3 Chromosomes shape,karyotype and karyotype pattern of A.sativa

染色體編號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度/%長(zhǎng)臂短臂總長(zhǎng)臂比染色體類(lèi)型16.744.9811.721.35m26.894.5211.411.52m36.924.3511.271.59m46.703.8810.581.73sm55.753.789.531.52m64.433.007.431.48m74.822.337.142.07sm84.472.667.131.68m94.602.136.732.16sm103.122.956.071.06m113.182.815.991.13m 12*3.111.824.931.71sm133.011.894.901.59m142.721.153.872.37sm152.201.443.641.53m161.921.683.591.14m17*2.361.143.502.08sm181.871.633.501.15m192.311.023.322.27sm201.751.553.301.13m212.081.043.122.01sm

注：*為隨體染色體，隨體長(zhǎng)度未計(jì)算在內(nèi)

增多。六倍體皮燕麥的核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)、染色體長(zhǎng)度比和臂比大于2的染色體數(shù)目均最高，其核型為不對(duì)稱(chēng)的2B型。隨著倍性的增加，染色體的核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)、染色體長(zhǎng)度比逐漸增加，且核型類(lèi)型也由對(duì)稱(chēng)的2A型轉(zhuǎn)為不對(duì)稱(chēng)的2B型，說(shuō)明六倍體燕麥的染色體形態(tài)更具有多態(tài)性。

表6 不同倍性燕麥種的核型比較

3 結(jié)論

3.1 不同倍性燕麥種核型特征

燕麥屬的分類(lèi)經(jīng)歷了由外部形態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)分類(lèi)過(guò)渡到以細(xì)胞染色體組為基礎(chǔ)、結(jié)合形態(tài)特征分類(lèi)的兩個(gè)階段。1919～1924年，對(duì)當(dāng)時(shí)掌握的10個(gè)燕麥種進(jìn)行了遠(yuǎn)緣雜交，并對(duì)親本及雜種的染色體做了觀察分析，據(jù)此將燕麥屬分為二倍體、四倍體和六倍體3個(gè)種群[18]。這種以其細(xì)胞遺傳基礎(chǔ)及特點(diǎn)進(jìn)行分類(lèi)的方法，也得到了形態(tài)分類(lèi)學(xué)家們的贊同。此后各國(guó)均以此作為燕麥屬分種的基礎(chǔ)。后來(lái)補(bǔ)充了9個(gè)種，加上后人陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新種(5個(gè)種)，現(xiàn)燕麥屬植物共有30個(gè)種[2]。

試驗(yàn)對(duì)二倍體、四倍體、六倍體材料進(jìn)行了染色體分析，發(fā)現(xiàn)二倍體材料的核型公式為2n=2x=14=10m+4sm(2SAT)，具有1對(duì)隨體、2對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體，研究結(jié)果與郭淑華[19]的報(bào)道一致，但在中部著絲點(diǎn)染色體數(shù)目上有差異。研究結(jié)果得出二倍體燕麥A.nudibreri有5對(duì)中部染色體，而郭淑華[19]的研究結(jié)果是4對(duì)中部染色體，這可能是材料來(lái)源不同造成的。四倍體燕麥A.hispanica具有4對(duì)近中部和10對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體，劉偉[11]發(fā)現(xiàn)四倍體燕麥A.maroccana有6對(duì)近中部和8對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體。對(duì)于六倍體燕麥A.sativa,梁國(guó)玲等[20]發(fā)現(xiàn)青引1號(hào)具有11對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體和10對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體，且在第7和第17號(hào)染色體上各含有一對(duì)隨體。核型公式為2n=6x=42=20m+22sm(4SAT)。盛中飛等[21]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄牙燕麥具有11對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體、9對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體和1對(duì)近端部著絲點(diǎn)染色體，第5、11、16號(hào)染色體上含有3對(duì)隨體，核型公式為2n=6x=42=18m+22sm(6SAT)+2st。而本研究發(fā)現(xiàn)，A.sativa染色體具有8對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體和13對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體，并且在第12和第17號(hào)染色體上均含有一對(duì)隨體。由此可見(jiàn)，不同倍性、不同種的燕麥染色體數(shù)目、核型不同，同一個(gè)種不同品種的核型結(jié)構(gòu)也有所不同。

3.2 不同倍性燕麥的進(jìn)化

Stebbins[17]和Levitzky[22]報(bào)道，染色體核型的進(jìn)化趨勢(shì)是由對(duì)稱(chēng)往不對(duì)稱(chēng)發(fā)展。二倍體燕麥A.nudibreri的核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為57.85%，染色體長(zhǎng)度比為1.72，核型為2A型，是較為原始的對(duì)稱(chēng)型。四倍體A.hispanica的核型雖然也屬2A型，但其核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)為60.53%，染色體長(zhǎng)度比為1.88，均高于二倍體燕麥A.nudibreri，因此，四倍體A.hispanica的染色體不對(duì)稱(chēng)型要大于二倍體燕麥A.nudibreri。六倍體的A.sativa核不對(duì)稱(chēng)系數(shù)進(jìn)一步增大，為61.01%，均高于二倍體和四倍體，其核型為2B型，進(jìn)化地位要高于四倍體和二倍體。