董家書 韋美德 周格琛 鄧開鳳 戴盛明

三陰性乳腺癌（triple?negative breast cancer，TNBC）約占所有乳腺癌的10%～20%［1］，因其侵襲力強(qiáng)，且缺乏有效的治療靶點(diǎn)，而成為預(yù)后極差的惡性腫瘤。抑癌基因的甲基化改變是三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件。文獻(xiàn)報(bào)道，PPAR?γ基因可通過調(diào)節(jié)Wnt信號傳導(dǎo)通路的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［2］。PPAR?γ是一種由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥信號通路如NF?KB、Ap?1、JAK?sTAT，抑制促炎介質(zhì)的生成［3］。有研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)PPAR?γ的表達(dá)是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抗炎作用所必須的［4］。5?氮雜?2?脫氧胞嘧啶（5?aza?2'?deox?ycytidine，5?Aza?CdR）是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性抑制劑，通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)鍵結(jié)合，抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶I的甲基轉(zhuǎn)移活性，除去抑癌基因啟動子的甲基化，解除甲基化對抑癌基因的抑制，從而使抑癌基因再表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用［5］。本研究擬選用不同濃度的 5?Aza?CdR 作用于乳腺癌MDA?MB?231細(xì)胞系，觀察該藥物對乳腺癌細(xì)胞PPAR?γ基因甲基化情況以及轉(zhuǎn)錄水平，以及對該細(xì)胞凋亡的影響，為探索乳腺癌化療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

MDA?MB?231細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、無菌PBS、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；5?Aza?CdR購自日本sigma公司，經(jīng)無菌PBS溶解后分裝，-80℃保存；DNA抽提純化試劑盒QIAamp DNA Mini Kit（貨號51304），重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit（貨號 59824），均購自德國凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司；總RNA提取試劑盒Mini BEST Universal RNA Extraction Kit（貨號9767），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Mir?X miRNA First?Strand Syn?thesis Kit（貨號 68313），PCR 試劑盒 PrimeScript?RT Master Mix（貨號 RR036），均購自日本 Takara公司；PCR引物由大連寶生物公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA?MB?231細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含1%青霉素、鏈霉素），于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的MDA?MB?23l細(xì)胞種入35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞充分貼壁后，加入含5、10、15、20 μmol/L的5?Aza?CdR完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞，對照組用不含5?Aza?CdR的普通完全培養(yǎng)液，并加入與藥物相同體積的PBS緩沖液，培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞。

1.3 甲基特異性PCR（methylmion specific PCR，MSP）檢測PPAR?γ基因甲基化情況

QIAamp DNA Mini Kit提取 5?Aza?CdR 處理細(xì)胞48 h后基因組DNA，EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit進(jìn)行重亞硫酸氫鹽修飾并回收DNA，利用甲基化以及非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PPAR?γ基因甲基化引物和非甲基化引物見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，進(jìn)行熔解曲線分析以確認(rèn)產(chǎn)物的特異性，4℃維持至結(jié)束。

表1 引物序列Table 1 Details of primers

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real?time fluorescent quan?tive PCR，qPCR）檢測PPAR?γmRNA表達(dá)水平

Trizol法提取藥物處理48 h后細(xì)胞的總RNA，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。PPAR?γ基因以及β?actin引物見表1。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min，進(jìn)行熔解曲線分析以確認(rèn)產(chǎn)物的特異性，4℃維持至結(jié)束。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測5?Aza?CdR對MDA?MB?231細(xì)胞凋亡的影響

取生長對數(shù)期MDA?MB?231細(xì)胞，胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)；含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×106個(gè)/mL接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，每組細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度 5?Aza?CdR（5、10、15、20 μmol/L）的RPMI1640培養(yǎng)液；對照組加同等體積的培養(yǎng)液，孵育48 h后胰酶消化收集細(xì)胞；凋亡試驗(yàn)取1×106個(gè)細(xì)胞，冷 PBS（2～8℃）洗 2 次，用 500 μL 1×An?nexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，濃度為1×106cells/mL，向細(xì)胞懸液中加5 μL Annexin V?FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min；加入10 μL PI染色液后輕輕混勻，2～8℃避光條件下孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MSP檢測PPAR?γ基因啟動子區(qū)域甲基化情況

5?Aza?CdR 藥物處理細(xì)胞后，PPAR?γ基因甲基化程度明顯降低，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 MDA?MB?231細(xì)胞PPAR?γmRNA表達(dá)情況

藥物作用48 h，RT?qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比PPAR?γmRNA 表達(dá)增加（P＜0.01）；隨著實(shí)驗(yàn)組藥物濃度的增加，PPAR?γmRNA表達(dá)略有增加，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 5?Aza?CdR 對 MDA?MB?231 細(xì)胞凋亡的影響

與空白對照組細(xì)胞相比，5、10、15、20 μmol/L 5?Aza?CdR處理組的細(xì)胞凋亡率分別為（14.1±2.3）%、（25.4±3.3）%、（32.7±2.8）%、（43.1±1.9）%，與對照組的（6.9±0.8）%相比，凋亡率增加（P＜0.05），藥物處理組間均有明顯差異（P＜0.05），見圖3。

圖1 5?Aza?CdR 對MDA?MB?231細(xì)胞PPAR?γ基因去甲基化的影響Figure 1 Effects of 5?Aza?CdR on PPAR?γdemethylation in MDA?MB?231 cells

圖2 5?Aza?CdR 對 MDA?MB?231細(xì)胞 PPAR?γmRNA表達(dá)的影響Figure 2 Effects of 5?Aza?CdR on PPAR?γmRNA expression in MDA?MB?231 cells

3 討論

乳腺癌是危害女性健康最常見的婦科腫瘤，而其中TNBC是惡性程度極高，預(yù)后極差的腫瘤，且對內(nèi)分泌治療不敏感［6］，至今仍然沒有具有針對性的治療方案。PPAR?γ是核受體基因超家族中的一員，在脂肪組織、結(jié)腸、脾臟及巨噬細(xì)胞中大量表達(dá)，并且通過配體依賴途徑影響相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的方式［7］，影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［8?9］。Abduljab?bar等［10］研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的PPAR?γ與沒有接受激素治療的雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性腫瘤患者的生存期延長有關(guān)［10］。張洪斌等［11］對 40例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織的檢測中亦發(fā)現(xiàn)，PPAR?γ表達(dá)高者，5年生存率平均為91%，弱陽性或陰性表達(dá)者，5年生存率平均為42%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本課題組前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織PPAR?γ表達(dá)低于癌旁組織，且PPAR?γ在MDA?MB?231（ER?）細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于MCF?7（ER+）乳腺癌細(xì)胞［12］。綜合以上結(jié)果，提示PPAR?γ低表達(dá)很有可能是ER陰性且5年生存率低的TNBC的重要因素。

圖3 不同濃度5?Aza?CdR作用MDA?MB?231細(xì)胞48 h后凋亡率的變化Figure 3 Changes of the apoptosis rate of MDA?MB?231 cells after treatment with different concentrations of 5?Aza?CdR for 48 h

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的重要方式之一，抑癌基因甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制，引起細(xì)胞代謝紊亂，是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一［13］。本課題組的另一部分研究結(jié)果表明乳腺癌患者PPAR?γ基因啟動子甲基化程度顯著高于健康對照。而基因異常甲基化導(dǎo)致的基因沉默是可以逆轉(zhuǎn)的過程，應(yīng)用甲基化酶抑制劑可以使基因發(fā)生去甲基化，恢復(fù)基因的表達(dá)［14］。許多研究已成功將 5?Aza?CdR應(yīng)用于體外培養(yǎng)的乳腺癌、宮頸癌等細(xì)胞株中，逆轉(zhuǎn)E鈣粘蛋白（E?cadherin）、RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白 2A基因（RAS associated domain family 2A，RASSF2A）和人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（Runt related transcription factor 3，RUNX3）等多種抑癌基因啟動子的甲基化狀態(tài)，恢復(fù)其表達(dá)，抑制腫瘤的生長［15?17］。研究已證實(shí)，PPAR?γ低表達(dá)與該基因的啟動子甲基化增加有關(guān)［18］。因此，本研究選用去甲基化藥物 5?Aza?CdR 作用 MDA?MB?231 細(xì)胞。經(jīng)檢測，PPAR?γ甲基化水平明顯降低，提示 5?Aza?CdR能夠有效解除PPAR?γ基因甲基化。同時(shí)，RT?qPCR檢測結(jié)果也顯示，與對照組相比，藥物處理組PPAR?γ表達(dá)水平顯著增加，但不同藥物濃度間無顯著差異，提示PPAR?γ在低濃度（10 μmol/L）5?Aza?CdR處理時(shí)即可顯著表達(dá)升高；然MDA?MB?231細(xì)胞凋亡增加卻有劑量依賴性，提示PPAR?γ可能參與了誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的部分作用。在袁昱寧的研究中，作者利用5?Aza?CdR作用MDA?MB?231細(xì)胞后檢測促進(jìn)凋亡的E?cadherin、Wnt抑制因子（Wnt inhibitory factor 1，WIF1）基因表達(dá)上調(diào)，且呈時(shí)間依賴性逐漸升高，而抑制凋亡的β?連環(huán)蛋白（β?catenin）的表達(dá)隨作用時(shí)間延長逐漸下降［15］；Long 等［19］的研究亦發(fā)現(xiàn) 5?Aza?CdR處理MDA?MB?231細(xì)胞后，特異AT序列結(jié)合蛋白 2（special AT?rich binding protein 2，SATB2）表達(dá)降低，miR?31表達(dá)升高，抑制了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜合以上結(jié)果，提示5?Aza?CdR可有效提高抑癌基因的表達(dá)，從而抑制MDA?MB?231腫瘤細(xì)胞的生長。

綜上，本研究提示，5?Aza?CdR 可有效降低PPAR?γ甲基化的水平，使其在mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)增加，促進(jìn)MDA?MB?231細(xì)胞凋亡，為表觀遺傳學(xué)藥物5?Aza?CdR用于TNBC治療提供更多實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。