何江耀 趙任龍 果海娜

在世界范圍內，宮頸癌是女性第4位常見的惡性腫瘤，僅2012年全球發(fā)生宮頸癌近53萬例，年死亡數高達27萬，其中85%宮頸癌發(fā)生于發(fā)展中國家，且居于這些國家癌癥死因的首位［1］。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染已被證實是宮頸癌發(fā)生的首要始動因素，其中99.7%的宮頸鱗狀細胞癌被發(fā)現(xiàn)與高危型人乳頭瘤病毒（high risk?human papilloma virus，HR?HPV）感染有關，而持續(xù)的HR?HPV感染是導致宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）并進一步引發(fā)宮頸癌病變的主要病因［2?4］。解脲支原體（ureaplasmaurealyticum，UU）為條件致病菌，可使宿主細胞膜及泌尿生殖道黏膜受損，進而影響細胞的生物合成及免疫功能［5］。UU感染使宮頸微環(huán)境產生不良變化可能是部分HR?HPV持續(xù)感染從而導致CIN發(fā)生的重要因素之一。本文通過對宮頸分泌物進行HPV分型檢測以及UU?DNA檢測，聯(lián)合做薄層液基細胞學檢查，分析探討生殖道HR?HPV合并UU感染與CIN發(fā)生的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

收集2014年8月至2017年6月間于婦科門診就診的女性患者和健康體檢者宮頸分泌物樣本，共1 159例，年齡18～72歲，平均年齡35.6歲，均未進行過抗HPV及UU的治療，顯微鏡下觀察待測的宮頸分泌物樣本中含脫落細胞為合格的標本，4℃冰箱內保存?zhèn)溆?，合格樣本方可進入實驗程序行檢測。

1.1.2 主要檢測儀器及試劑

Luminex?200TM多功能流式點陣儀（Luminex公司，美國）；CFX96 TouchTM實時熒光定量PCR儀（BioRad公司，美國）；Mx3000P實時熒光定量PCR儀（Stratagene公司，美國），德國 Eppendorf公司5333 PCR儀；人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒（流式熒光雜交法）（上海透景生命科技有限公司）；解脲脲原體核酸檢測試劑盒（PCR?熒光探針法）（中山大學達安基因股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 HR?HPV分型檢測

本實驗按HPV分型檢測試劑盒說明書進行操作：將宮頸分泌物樣本振蕩，12 000 r/min離心5 min取沉淀，加入裂解液100℃煮沸10 min，取上清2 μL加入反應管中于5333型PCR儀上行PCR擴增，所得PCR產物與微球上交聯(lián)的探針根據堿基互補配對的原理進行雜交，再加入熒光標記物以標記微球上的探針，最后在Luminex?200TM多功能流式點陣儀上檢測熒光信號并進行判讀，并記錄實驗結果。人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒可檢測17種 HR?HPV亞型，分別是：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82。

1.2.2 UU核酸檢測

按解脲脲原體核酸檢測試劑盒說明書進行檢測操作：將宮頸分泌物樣本振蕩，12 000 r/min離心5 min取沉淀，加入裂解液100℃煮沸10 min，取上清2 μL加入反應管中，用CFX96 TouchTM實時熒光定量PCR儀或Mx3000P實時熒光定量PCR儀檢測待測樣品并捕獲熒光信號，并記錄實驗結果。參照說明書判定檢測結果：如果增長曲線呈S型曲線且Ct值＜27，結果判定為陽性，該樣品的UU DNA含量=樣品的Qty/20基因拷貝；如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值=30，判定為陰性，樣品的UU DNA 含量＜5.0×102基因拷貝；如果27≤Ct值＜30，則為實驗灰度區(qū)，需重復實驗一次，若重復增長曲線呈S型曲線且Ct值＜30，判為陽性結果，否則為陰性。每批檢測按試劑盒內提供的陽性質控品與陰性質控品作對照。

1.2.3 細胞病理學檢查

在1 159例受檢者中隨機選擇122例樣本采用離心沉降式薄層液基細胞制片法制片，95%乙醇固定，經巴氏染色，封片，光鏡觀察。由2名有經驗的病理醫(yī)生進行閱片并作出相應診斷，病理診斷標準根據宮頸細胞學Bethesda系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）（2001）修訂版內容對 CIN 進行分級［6］，同時將病理診斷≥CINⅠ即視為發(fā)生宮頸上皮內瘤變。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數據均以百分率（%）表示，使用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計學分析。根據資料采用χ2檢驗和Fisher精確概率法進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HR?HPV亞型陽性感染情況

受檢的1 159例女性內分泌物標本中，17種HR?HPV陽性感染者共243例，總陽性感染率為20.97%（243/1 159），其中HPV52亞型感染率最高，陽性感染率為 4.23%（49/1 159），其次為HPV16和 58亞型，陽性感染率分別為3.88%（45/1 159）和2.76%（32/1 159）；單一高危亞型陽性感染率為17.08%（198/1 159），多重高危亞型陽性感染率為3.88%（45/1 159）。各亞型的陽性感染情況見表1。

2.2 HR?HPV與UU合并感染情況

本次研究受檢者中UU總陽性感染率為67.56%（783/1 159）。HR?HPV合并UU感染情況見表2，在783例UU陽性患者中，HR?HPV陽性188例，陽性率為24.01%（188/783）；在UU檢測陰性的376例患者中，HR?HPV陽性55例，陽性率為14.63%（55/376），2組相比差異具統(tǒng)計學意義（χ2＝13.50，P=0.000 2）（表 2）；不同 UU?DNA載量組的HR?HPV檢測結果見表3，UU≥103cop?ies/mL組 HR?HPV 陽性率占 23.42%（182/777），明顯高于UU＜103copies/mL組陽性率 15.97%（61/382），2組相比差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.59，P=0.003 4）。

2.3 HR?HPV亞型合并感染UU情況

HR?HPV亞型合并UU陽性感染情況如下：HPV26亞型合并UU陽性感染率達100%（1/1），但考慮其研究病例數過少，不具有統(tǒng)計意義；HPV16陽性患者中UU陽性感染率最高，為93.33%（42/45），其次為HPV39和HPV58，合并UU陽性感染率分別為85.00%（17/20）和84.38%（27/32）；HPV16與其它HR?HPV亞型組合并UU陽性感染率相比，HPV16陽性組合并UU陽性感染率顯著升高，差異具統(tǒng)計學意義（χ2＝7.66，P=0.005 6）。

表1 HR?HPV各亞型的感染情況Table 1 The infection of HR?HPVsubtypes

表2 HR?HPV合并UU感染情況Table 2 The infection of HR?HPV combined with UU

表3 不同UU?DNA載量標本的HR?HPV檢測結果Table 3 The infection of HR?HPV in different concentrations of UU?DNA

2.4 HR?HPV合并UU陽性感染的CIN發(fā)生情況

1 159 例受檢者中隨機選擇122例行薄層液基細胞學檢查。如表4所示，病理診斷為發(fā)生CIN者共23例，總CIN發(fā)生率為18.85%（23/122）。其中在HR?HPV合并UU陽性感染的患者中，CIN發(fā)生率41.9%（13/31）最高，較其他單純感染及陰性對照組中的CIN發(fā)生率顯著升高，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 HR?HPV合并UU感染CIN發(fā)生情況Table 4 The influence of HR?HPV/UU co?infection on cervical intraepithelial neoplasia

3 討論

HPV是一種雙鏈環(huán)狀的小分子DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)的與人類生殖道相關的亞型有40余種，其中約有20種被證實與腫瘤的發(fā)生有關［7］。根據致癌風險的高低大致可分為HPV高危型人乳頭瘤病毒（HR?HPV）和低危型人乳頭瘤病毒（low?risk human papilloma virus，LR?HRV）其中 LR?HPV可引起宮頸良性病變，而HR?HPV引發(fā)宮頸上皮內瘤樣病變和宮頸癌［8］。HPV分布具有區(qū)域特性，不同地區(qū)的HPV高發(fā)型存在差異。HPV16型致癌的風險最高，全球約55%～60%的宮頸癌是由HPV16引起的，而HPV52型和58型在亞洲的檢出率較高［9］。長期的流行病學及循證醫(yī)學研究已證實，HR?HPV感染是宮頸癌的主要原因，可以導致宮頸癌前病變和浸潤性宮頸癌發(fā)生，且有90%以上的宮頸癌中存在高危型HPV感染［10］。然而在體外細胞轉化研究中發(fā)現(xiàn)，HPV僅能誘導人正常上皮細胞的永生化而不能使之充分向惡性轉化［11］。因此，HR?HPV 的持續(xù)感染在CIN病變中起重要作用，且與宮頸癌的發(fā)生密切相關［12?14］。

解脲支原體是寄生于女性泌尿生殖道內較為常見的一種致病性病原菌，可引起女性尿道炎、盆腔炎等疾?。?5］。相關研究報道，UU感染可能與CIN的發(fā)生有關，可協(xié)同促進宮頸癌前病變或宮頸癌的發(fā)生，在HR?HPV導致CIN或宮頸癌中發(fā)揮重要輔助作用［16］。通過檢測分析HR?HPV與UU感染情況及與CIN發(fā)生的相關性，有助于探討其引起宮頸癌變的可能作用機制，為宮頸癌的篩查及早診早治提供理論依據及研究思路。

本研究受檢的1 159例樣本中，HR?HPV陽性率為20.97%（243/1 159），要低于陜西省榆林地區(qū)［17］HR?HPV的感染率25.85%（190/735），高于無錫地區(qū)［18］HR?HPV 的感染率 10.53%（1 288/12 226），而與東莞邵錦歡等［19］報道的 21.89%（4 466/20 400）相近，這也充分說明東莞地區(qū)的HR?HPV感染率相對處于一個中間水平，很可能與東莞地區(qū)人員結構復雜，來自全國各地有關。本研究中UU感染率為67.5%（783/1 159），這與李國立等［20］報道的結果相接近，而較王剛等［21］報道的UU培養(yǎng)陽性感染率49.66%（3 390/6 826）要高，可能與其UU的核酸檢測法比培養(yǎng)檢測敏感性更高有關。Lukic等［22］研究表明，UU感染可增加HR?HPV感染的風險，可能作為HR?HPV感染的輔助因子，在HR?HPV侵入宮頸上皮細胞及HR?HPV持續(xù)感染過程中起重要作用。本研究結果也表明，在UU陽性感染者中HR?HPV的陽性率（24.01%，188/783）顯著高于UU陰性患者中HR?HPV陽性率（14.63%，55/376），且隨著UU?DNA載量的增加，HR?HPV感染風險增加。UU的毒力因子主要由尿素酶、免疫球蛋白A（IgA）蛋白酶、磷脂酶A、磷脂酶C以及多帶抗原基因等5種蛋白與產生過氧化物的酶系統(tǒng)構成，其吸附于機體后可通過損傷宿主細胞膜及泌尿生殖道黏膜屏障，繼而影響細胞的生物合成及免疫系統(tǒng)，增加機體對于HPV的易感性，同時也增加了HPV感染的暴露機會［23］。此外本研究進一步發(fā)現(xiàn)，高致病性的HPV16亞型患者中UU陽性率最高，要顯著高于其他各亞型中合并UU的陽性感染率（P＜0.01），提示UU感染可能更易增加HPV16亞型的感染風險。

針對本研究隨機選取的122例樣本進行薄層液基細胞學檢查，細胞學檢查結果顯示，在被檢測為UU陽性組中的CIN發(fā)生率（26.25%，21/80）明顯高于UU陰性組（4.76%，2/42），此結果與以往的報道相吻合，UU感染與宮頸病變的發(fā)生及進展密切相關［16，22］；同時相較于其他單純感染及陰性對照組CIN發(fā)生情況而言，在HR?HPV合并UU陽性感染的患者中CIN發(fā)生率顯著升高，表明HR?HPV合并UU陽性感染可提高患者CIN的發(fā)生，與CIN病變密切相關。

綜上所述，UU感染可增加HR?HPV感染的風險，且兩者協(xié)同促進CIN的發(fā)生，但HR?HPV與UU是怎樣一個協(xié)同機制導致病變發(fā)生，目前還不明確，有待更進一步深入研究。但在臨床防治CIN時需重視HR?HPV與UU合并感染的情況。