羅 虎，李永恒,孫振江,梁坤國,許旺發(fā),賴銘雪

(廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司，廣西 北海 536100)

燃料乙醇作為一種可再生的清潔能源，受到世界各國的青睞[1]。隨著世界燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，玉米等糧食的消耗量大大增加，燃料乙醇產(chǎn)業(yè)與人畜爭糧的矛盾日益突出，因此，糧食作物原料的有限供給制約了燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，發(fā)展“非糧”木薯燃料乙醇已成為世界燃料乙醇技術(shù)的發(fā)展趨勢[2-3]。傳統(tǒng)的燃料乙醇發(fā)酵工業(yè)是能耗較高的產(chǎn)業(yè)，蒸煮工段能耗約占整個乙醇生產(chǎn)總能耗的30%，因此，從節(jié)約蒸煮工段的能耗來說，生料發(fā)酵作為一種邊糖化邊發(fā)酵的乙醇生產(chǎn)新工藝，正受到世界各國的關(guān)注[4-6]。

同傳統(tǒng)木薯發(fā)酵酒精技術(shù)相比，生料發(fā)酵乙醇工業(yè)的最大優(yōu)點體現(xiàn)在下面幾個方面[7]。首先，在熟料發(fā)酵工藝中，液化工序消耗蒸汽占整個發(fā)酵過程中蒸汽消耗的30%。而生料發(fā)酵無需對原料蒸煮和冷卻，這樣可以節(jié)約能耗以及相關(guān)設(shè)備的購置和維護(hù)費用，可以大大降低生產(chǎn)成本[8-9]。其次，在傳統(tǒng)工藝中，高溫蒸煮會導(dǎo)致一些可發(fā)酵性糖的損失和非發(fā)酵性雜質(zhì)的產(chǎn)生，造成淀粉利用率低[10]。而生料發(fā)酵工藝不會帶來這些問題，且發(fā)酵過程中滲透壓較低，有利于酵母生長。因此，生料發(fā)酵的酒精度較高，可以高達(dá)18%以上，淀粉利用率也很高。最后，在傳統(tǒng)蒸煮工藝中，料液黏度較高，限制發(fā)酵醪濃度的提升。由于無需蒸煮，生料發(fā)酵液中物料黏度小，料液輸送性能良好，有利于實現(xiàn)高濃度發(fā)酵。同時，由于發(fā)酵液黏度小，換熱效果好，乙醇蒸餾過程可節(jié)省大量的蒸汽和冷卻水[11]。

最近幾年來，對木薯生料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的研究取得了一定進(jìn)展。首先，馬文超[12]和沈暉等[13]分別對玉米和木薯生料發(fā)酵制備乙醇的工藝條件進(jìn)行了研究，此后，黃加軍等[14]驗證了高效生淀粉酶對發(fā)酵的促進(jìn)作用。最近，申乃坤等[15]則對木薯生料發(fā)酵生產(chǎn)高濃度燃料乙醇的工藝進(jìn)行研究，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

高效生淀粉酶的出現(xiàn)使液化效果可以達(dá)到發(fā)酵工藝要求，但受到混合不均、反應(yīng)效率下降的影響，淀粉酶的添加量比噴射工藝的用量有所增加。然而，對高效設(shè)備的投資及新型酶制劑的使用并不一定會帶來效益和增值。有些工藝在拌料過程中加熱至糊化點以下的溫度，調(diào)節(jié)pH，加入酶制劑攪拌混合進(jìn)行一段時間的預(yù)液糖化，再降溫進(jìn)入發(fā)酵[16]；而其他工藝在發(fā)酵溫度下拌料后直接進(jìn)行同步酶水解(糖化)和發(fā)酵過程，兩種工藝都可以達(dá)到較高的酒精度和酒精轉(zhuǎn)化率，哪種工藝更具優(yōu)勢需要進(jìn)一步研究比較。生料發(fā)酵工藝往往與濃醪發(fā)酵聯(lián)系在一起，大多數(shù)研究中，配料干物濃度都在 30%以上。對濃醪生料發(fā)酵干物濃度與淀粉出酒率關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，生料工藝隨著拌料干物濃度的提高(最高達(dá)33%)，發(fā)酵醪液的淀粉出酒率不斷提高，這意味著糧單耗的降低，但殘總糖和殘淀粉的含量也逐步提升[17]。

本文中，筆者擬利用正交試驗法對木薯生料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，確定最佳的工藝優(yōu)化條件，以期為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯粉，廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司；尿素(總氮≥46.4%)，湖南宜化化工有限責(zé)任公司；生料淀粉酶，諾維信公司；糖化酶，杰能科有限公司；酵母，安琪有限公司；濃H2SO4、NaOH，市售分析純。

1.2 儀器設(shè)備

U3000型高效液相色譜儀，美國戴安公司；CX21-310型數(shù)碼生物顯微鏡，奧林巴斯株式會社；BIOF6050B/3型50 L三聯(lián)中試發(fā)酵罐，上海高機(jī)生物工程有限公司；SKY-110X型往返式水浴恒溫振蕩器，上海蘇坤實業(yè)有限公司；S40型精密型臺式pH/電導(dǎo)率測量儀，梅特勒-托利多有限公司；HWY-2102型雙層大容量恒溫?fù)u床，上海智誠有限公司；MF-50型水分測定儀：日本AND公司。

1.3 試驗方法

木薯生料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇工藝見圖1。

圖1 工藝流程Fig.1 Diagram of fuel ethanol production with cassava raw materials

除去木薯原料中石塊、鐵塊、編織物等雜質(zhì)后，通過粉碎機(jī)破壞木薯的組織結(jié)構(gòu)，使淀粉充分釋放。粉碎后的木薯粉配制成一定濃度的粉漿，同時添加漂白粉和酶試劑，輸送至發(fā)酵罐進(jìn)行浸泡處理。此后，向浸泡好的粉漿中添加擴(kuò)培好的酵母(水常溫活化1 h)以及青霉素和營養(yǎng)鹽等，進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。發(fā)酵后的成熟醪經(jīng)蒸餾和分子篩脫水后，獲得燃料乙醇成品。具體實驗方法如下。

1.3.1 調(diào)漿水溫影響實驗

按料水比為1∶ 2.0配料，添加1.0×10-5mol/L的殺菌劑和15 U/g的淀粉酶，經(jīng)過不同溫度(35～55 ℃)浸泡2 h后，降溫至33 ℃，并加入0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的干酵母、1.0×10-5mol/L的殺菌劑和0.20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的尿素，發(fā)酵溫度維持33 ℃，發(fā)酵120 h。

1.3.2 料水比影響實驗

按不同料水比(1∶ 3～1∶ 1.8)配料，浸泡溫度50 ℃，其他條件同1.3.1節(jié)。

1.3.3 不同干酵母添加量影響實驗

按料水比為1∶ 2.0配料，酵母添加量為0.05%～0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，其他條件同1.3.2節(jié)。

1.3.4 發(fā)酵溫度影響實驗

酵母添加量為0.10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，發(fā)酵溫度28～42 ℃，其他條件同1.3.3節(jié)。

1.3.5 發(fā)酵周期影響實驗

發(fā)酵溫度34 ℃，其他條件同1.3.4節(jié)，分析不同發(fā)酵周期(40～140 h)對發(fā)酵的影響。

1.3.6 節(jié)氮源影響實驗

發(fā)酵周期120 h，其他條件同1.3.5節(jié)，分析不同氮源添加量對發(fā)酵的影響。

1.4 檢測方法

殘?zhí)呛繙y定按照斐林試劑法[18]進(jìn)行。

外觀糖度、酒精度、揮發(fā)酸和酸度等按照酒精廠常規(guī)分析測定方法[19]。殘淀粉和殘糊精計算見式(1)和(2)。

殘淀粉含量=ρ(殘總糖)-ρ(過濾總糖)×0.9

(1)

殘糊精含量=ρ(過濾總糖)-ρ(還原糖)×0.9

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 粉漿浸泡對發(fā)酵的影響

圖2 調(diào)漿水溫對發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of water temperature on the fermentation results

為了解決生料發(fā)酵過程中發(fā)酵初始酵母沒有可直接利用的碳源問題，通過不同調(diào)漿水溫(35～55 ℃)對淀粉進(jìn)行浸泡酶解，使初始發(fā)酵液中存在一部分酵母可利用的糖，然后在33 ℃發(fā)酵條件下生料酶繼續(xù)將淀粉進(jìn)行酶解，持續(xù)釋放出小分子糖，結(jié)果見圖2。由圖2可知：提高調(diào)漿水溫有利于提高出酒率，降低殘總糖含量，可提高原料的利用率，但是木薯淀粉的糊化溫度為60～70 ℃，過高的水溫不僅增加能耗，且會導(dǎo)致粉漿糊化，不利于物料的輸送。木薯淀粉經(jīng)溫水調(diào)漿后保溫浸泡一段時間，可使淀粉顆粒吸水膨脹，有利于下一步酶的液化水解，從而提高出酒率，縮短發(fā)酵時間。因此，調(diào)漿水溫控制在55 ℃為宜。

2.2 料水比對發(fā)酵的影響

料水比是發(fā)酵時加入的原料與水用量的比值，它對發(fā)酵結(jié)果有重要的影響。高濃度的生料發(fā)酵，加水量少，粉漿濃度高，后期產(chǎn)生的廢水也相對減少，但是粉漿濃度高，黏度相對也大，傳質(zhì)傳熱差，不利于物料的傳熱和酶解。同時，高底物濃度引起滲透壓升高，對酶和酵母產(chǎn)生一定的抑制作用。因此，考察料水比對發(fā)酵的影響，1 t木薯加酶2 kg,結(jié)果見圖3。

圖3 料水比對發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of material to water ratio on the fermentation results

由圖3可知：隨著料水比的降低，發(fā)酵得到的酒精度逐漸降低，發(fā)酵醪液黏度也隨之降低。這可能是由于乙醇發(fā)酵屬于厭氧發(fā)酵，當(dāng)加水量較多時，厭氧條件較好，而發(fā)酵醪濃度太稀降低了酶的濃度，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，酒精度降低。同時料水比太高，黏度增大，影響物料輸送，物料傳質(zhì)傳熱效果差，最佳的料水比應(yīng)該是黏度越低，發(fā)酵酒精度越高。綜合發(fā)酵酒精度和實際生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)效益，最佳的料水比為1∶ 1.86(即粉漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.1%)。

2.3 活性干酵母接種量對發(fā)酵的影響

酵母生長合成自身所需要的營養(yǎng)成分會消耗掉一部分糖，造成糖分的損失，發(fā)酵酒分下降。接種量過多會造成原料的浪費，并增加生產(chǎn)成本，而接種量過少會延長發(fā)酵周期，設(shè)備利用率低。因此，考察發(fā)酵初始活性干酵母的接種量對發(fā)酵的影響，結(jié)果見表1。

表1 接種量對發(fā)酵的影響

由表1看出:隨著活性干酵母用量的增加，發(fā)酵酒精度和還原糖、殘總糖含量變化波動較大，但是不同處理方式間相差不明顯。當(dāng)接種量為0.10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，發(fā)酵得到的酒精度較高，且還原糖和殘?zhí)橇勘容^低。因此，接種0.10%的活性干酵母對發(fā)酵比較合適。

2.4 溫度對發(fā)酵的影響

發(fā)酵過程中，溫度不但會影響酵母的生長代謝，而且會影響酶的催化活性。因此，考察發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of temperature on the fermentation results

由圖4可知：發(fā)酵溫度為28～36 ℃時，溫度對發(fā)酵得到的酒精度影響不大；但溫度>36 ℃時，發(fā)酵液中的殘總糖增高，酒精度也隨之降低，表明高溫抑制了酵母的生長，代謝活力降低，發(fā)酵速度減慢。因此，該酵母菌株的發(fā)酵溫度為32～36 ℃。

2.5 發(fā)酵周期的影響

酒精發(fā)酵是典型的產(chǎn)物抑制，在酒精度達(dá)到4%左右時，就開始產(chǎn)生抑制，發(fā)酵速度逐漸降低，當(dāng)酒精度達(dá)到一定數(shù)值后，再繼續(xù)延長發(fā)酵時間已沒有太大意義。因此，考察發(fā)酵周期對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵周期影響實驗

從表2可以看出：隨著發(fā)酵時間的延長，酒精度逐漸增高，還原糖和殘總糖量逐漸降低。綜合考慮設(shè)備的利用率情況，可以選120 h為適宜發(fā)酵時間。

2.6 氮源對發(fā)酵的影響

氮源是構(gòu)成菌體物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物的必需營養(yǎng)物質(zhì)，是酵母細(xì)胞合成代謝的重要原料。因此，需要通過實驗，了解生料發(fā)酵過程中氮源對酵母的影響。實驗結(jié)果表明，發(fā)酵24 h時，添加尿素的醪液樣品中酵母數(shù)最大，并進(jìn)入發(fā)酵高峰期，比空白對照樣增加了2倍左右(數(shù)據(jù)未顯示)。這個結(jié)果說明在發(fā)酵過程中，添加適量的氮源，可以促進(jìn)酵母的生長。

進(jìn)一步考察尿素增加量對發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同尿素添加量對發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of urea dosage on the fermentation results

由圖5可知：尿素添加量在0.20%時，酒精度，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵得到的酒精度越高、殘總糖含量越低。尿素添加量小于0.20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，發(fā)酵得到的酒精度較低、殘總糖較高，表明氮源添加量不足，酵母生長與代謝受到影響。而當(dāng)尿素添加量高于0.25%時，對發(fā)酵效果的影響不明顯(圖5)。綜合成本因素，尿素添加量以0.20%～0.25%為宜。

2.7 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

為了進(jìn)一步確定木薯粉生料發(fā)酵酒精的最佳條件，以發(fā)酵酒精度為指標(biāo)，選擇料水比、溫度、氮源、接種量和發(fā)酵周期5個因素進(jìn)行四水平正交試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，誤差分析見表4。

表3 L16(45)正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 誤差分析

由表4可知：木薯粉生料發(fā)酵酒精的最優(yōu)水平組合是A2B2C1D3E3，即料水比1∶ 2.0、溫度32 ℃、氮源2.0 g/L、接種量0.15%、發(fā)酵周期120 h；根據(jù)極差R值，影響因子主次順序依次為E、A、B、C、D，即發(fā)酵時間、料水比、溫度、氮源、接種量。

進(jìn)一步對表3正交試驗得到的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

由表5可知：料水比、發(fā)酵周期對木薯粉發(fā)酵酒精影響顯著，其余4個因素的影響不顯著。

表5 方差分析

因此，在正交試驗得到的最佳條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗來驗證，具體結(jié)果見表6。

表6 最佳條件下的發(fā)酵酒精度

由表6可知：在最佳條件A2B2C1D3E3下進(jìn)行3次驗證試驗，試驗的發(fā)酵酒精度平均為15.12%，淀粉利用率91.33%，并且3次試驗的結(jié)果較穩(wěn)定，說明該工藝組合效果好、可靠，適合木薯粉生料發(fā)酵酒精。

3 結(jié)論

通過單因素影響實驗，初步確定了木薯生料發(fā)酵條件為：調(diào)漿水溫為50～55 ℃、料水比為1∶ 2.0，活性干酵母接種量為0.10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，發(fā)酵溫度32～34 ℃，發(fā)酵周期120 h，尿素添加量為0.20%～0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

通過正交試驗分析主要的影響因素，影響因子主次順序依次：發(fā)酵時間、料水比、溫度、氮源、接種量。并進(jìn)一步確定了最佳條件：料水比1∶ 2.0，活性干酵母接種量0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵周期120 h，尿素添加量0.20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。該條件下發(fā)酵得到的酒精度可到達(dá)15.12%(體積分?jǐn)?shù))，淀粉利用率91.33%。