孫思佳，翟 磊，許 玲，于盼盼，白秀彬，姚 粟

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，北京100015；2.山東扳倒井股份有限公司，山東淄博256300）

芝麻香型白酒是我國傳統(tǒng)白酒的創(chuàng)新酒種之一，以其獨特的清濃醬融合的生產(chǎn)工藝特點和優(yōu)雅的芝麻香味而聞名，深受國內(nèi)外消費者青睞，市場發(fā)展前景廣闊[1]。芝麻香型白酒的釀造離不開大曲，大曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，含有多種微生物及生物酶，對白酒品質(zhì)具有重要影響。然而，目前白酒大曲的生產(chǎn)仍采用自然富集接種的生產(chǎn)方式[2]，受自然環(huán)境影響較大，存在大曲原料利用率低、出酒率低、用曲量大、生產(chǎn)成本高等一系列問題。大曲品質(zhì)與大曲微生物和所產(chǎn)的生物酶系關(guān)系密不可分，因此，深入研究大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，掌握微生物菌群變化規(guī)律，剖析優(yōu)勢菌群與大曲質(zhì)量之間的關(guān)系，利用微生物強化技術(shù)將篩選得到的功能性微生物應(yīng)用到傳統(tǒng)大曲生產(chǎn)制備過程中，對于提高大曲品質(zhì)具有重要意義。

近年來，不少學者專家開始將篩選得到的高溫大曲功能性微生物應(yīng)用于大曲生產(chǎn)過程，并取得了良好的效果[3-5]。本課題組在扳倒井芝麻香型白酒高溫大曲群落結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，大曲發(fā)酵前期“上霉”的好壞與成品曲的品質(zhì)密切相關(guān)，影響白酒釀造過程；“上霉”是指大曲發(fā)酵前期表面呈現(xiàn)的致密的白色小點，本課題組通過分離鑒定，發(fā)現(xiàn)其并非“霉菌”，而為扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該菌株是扳倒井高溫大曲發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌。扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）屬于復膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae），復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），是一類能夠產(chǎn)生子囊孢子的二形態(tài)酵母[6]；廣泛分布于高淀粉含量基質(zhì)中，能夠分泌包括淀粉酶[7]在內(nèi)的多種水解酶，在釀酒行業(yè)極具應(yīng)用價值[8-9]。目前，包括陳美竹[10]、王曉丹[11]在內(nèi),已有不少學者從高溫大曲中分離得到過扣囊復膜孢酵母（S.fibuligera），但對于其在強化大曲中的生產(chǎn)應(yīng)用鮮見報道。

本課題組近年來圍繞扣囊復膜孢酵母CICC 33077展開研究，發(fā)現(xiàn)該菌株能產(chǎn)生發(fā)達菌絲，具有良好的溫度、pH值耐受性[12]；同時具有較強的產(chǎn)淀粉酶能力，酶活力達到12000 U/g，且所產(chǎn)淀粉酶在酸性高溫條件下能保持70%以上酶活力，適合大曲發(fā)酵環(huán)境，有強化應(yīng)用于大曲生產(chǎn)的潛力。因此，本研究采用微生物強化技術(shù)，通過表面噴灑和內(nèi)部混料方式將扣囊復膜孢酵母CICC 33077應(yīng)用于芝麻香型白酒高溫大曲的生產(chǎn)，通過比較強化大曲和對照大曲的感官特性、微生物指標、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和發(fā)酵酒樣來解析扣囊復膜孢酵母CICC 33077在大曲制備過程中發(fā)揮的作用，提升芝麻香型白酒高溫大曲的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗菌株：扣囊復膜孢酵母CICC 33077分離于扳倒井芝麻香型白酒高溫大曲，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

試劑及耗材：麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA），購自北京陸橋技術(shù)有限公司；麥芽浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；磷酸氫二鉀，購自北京化工廠。液體培養(yǎng)基：麥芽浸粉3.586%，大豆蛋白胨1.216%，蛋白胨1.470%，磷酸氫二鉀1.148%，pH 7.0。麩皮固體培養(yǎng)基：麩皮25 g，水含量40%。

糖化液：蔗糖20 g、磷酸銨1.25 g、磷酸二氫鉀1.25 g，溶解定容至250 mL。

設(shè)備：pH計FE20購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱BHG-8082型購于上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 扣囊復膜孢酵母CICC 33077菌劑制備

斜面種子的制備：將扣囊復膜孢酵母CICC 33077凍干菌粉接種于MEA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h后，取單菌落再次接種于MEA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h制備得到斜面種子。

一級種子的制備：取一環(huán)試管斜面種子轉(zhuǎn)接到到液體培養(yǎng)基中，以30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進行一級種子的制備，得一級種子液。

二級種子的制備：將一級種子液按10%接種量接入到麩皮固體培養(yǎng)基中，30℃下發(fā)酵培養(yǎng)4 d進行二級種子的制備，得到二級種子。

菌劑制備：收集扣囊復膜孢酵母CICC 33077二級種子，通過真空冷凍干燥（12%脫脂牛奶作為保護劑）制備得到扣囊復膜孢酵母CICC 33077菌劑，該菌劑的活菌數(shù)達到107～108cfu/g，應(yīng)用于后續(xù)的芝麻香型白酒高溫大曲的生產(chǎn)。

1.2.2 扣囊復膜孢酵母CICC 33077在高溫大曲生產(chǎn)中的強化

采用微生物強化技術(shù)，將扣囊復膜孢酵母CICC 33077應(yīng)用于芝麻香型高溫大曲生產(chǎn)。通過表面噴灑和內(nèi)部混料的方式對高溫大曲進行微生物強化，共制備3房大曲，每房約1800塊，分別以表面噴灑方式進行扣囊復膜孢酵母CICC 33077強化；通過內(nèi)部混料方式進行扣囊復膜孢酵母CICC 33077強化，進行大曲強化的曲房每塊大曲加入7～8 mL終濃度為6×105cfu/mL的菌液；不添加扣囊復膜孢酵母CICC 33077菌劑的大曲為對照組。

1.2.3 強化大曲品質(zhì)特性的測定

扣囊復膜孢酵母在大曲制備的前期是優(yōu)勢菌，能夠形成肉眼可見的白色斑點，是高溫大曲生產(chǎn)前期的重要指標。根據(jù)該菌在高溫大曲生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的規(guī)律，將第一次翻曲（發(fā)酵9 d）做為本研究的采樣點。為了保證采樣的均一性，采用五點法結(jié)合四分法進行采樣。具體的采樣方式：在曲房的四角和中間5個位置各取1塊長勢良好的高溫大曲曲塊，混合均勻后，使用四分法進行采樣，供后續(xù)試驗測定使用。

1.2.3.1 強化大曲感官指標評定

對接種扣囊復膜孢酵母CICC 33077的強化大曲與對照大曲進行感官鑒定，并按照扳倒井股份有限公司企業(yè)標準《大曲評分標準》（BDJ/JW-WSW-06）中大曲感官指標的評價標準（表1）進行評分。

1.2.3.2 強化大曲微生物指標測定

采用稀釋涂布平板法，對強化大曲和對照大曲中的扣囊復膜孢酵母進行計數(shù)。通過菌落形態(tài)特征觀察，挑選乳白色，平伏，質(zhì)地絨狀，具有扣囊復膜孢酵母典型特征的菌落進行計數(shù)，并隨機挑取4個計數(shù)的單菌落，采用多相分類鑒定技術(shù)確定其分類學地位。

1.2.3.3 強化大曲內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析

利用掃描電鏡對接種扣囊復膜孢酵母CICC 33077的強化大曲和對照大曲的結(jié)構(gòu)進行解析。取10 g高溫大曲樣品在60℃烘箱中過夜干燥后，制備成2 mm×2 mm×2 mm小曲塊后放置在樣品臺上，利用噴金-離子濺射儀（BAL-TEC SCD005）對固定的樣品進行噴金，使用掃描電鏡Hitachi SU8010進行高溫大曲結(jié)構(gòu)的解析。

1.2.3.4 強化大曲理化指標測定

對強化大曲與對照大曲的水分、酸度、淀粉含量、液化力、糖化力、酯化力[13]以及發(fā)酵力進行測定。

發(fā)酵力測定：采用CO2失重法；取50 mL糖化液于三角瓶中，用油紙包好瓶口，在恒溫水浴內(nèi)沸騰1 h至糖化液微黃時取出，待冷卻至室溫（30℃）后加入1 g預(yù)測定的大曲試樣，稱重；將三角瓶置于30℃保溫24 h后再次稱重，兩次稱量之差為CO2損失的重量。按照下列公式計算大曲發(fā)酵力：

注：1.75系依麥塞爾（MIESSI）氏規(guī)定。

依據(jù)扳倒井股份有限公司企業(yè)標準《大曲評分標準》（BDJ/JW-WSW-06）中大曲理化性質(zhì)的評價標準（表2）對強化大曲與對照大曲的理化特性評分，并綜合高溫大曲的感官評價指標和理化指標，對大曲進行評定，給出強化大曲與對照大曲的品質(zhì)等級。

表1 高溫大曲感官鑒定評分標準

表2 高溫大曲理化評分標準

1.2.4 強化大曲的發(fā)酵實驗

將出房后的對照大曲和強化大曲接種到大米發(fā)酵液，發(fā)酵并蒸餾后進行感官評定。大米發(fā)酵液具體制備過程如下：取大米800 g，粉碎，加入4倍水，熬制至完全糊化后加入2倍水，冷卻至70℃，加入適量液化酶液化，并利用碘液判斷是否液化完全。液化完全的大米發(fā)酵液滅菌后，接種對照大曲和強化大曲，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。蒸餾發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵醪，并取蒸餾出的50 mL酒液作為最終產(chǎn)品，進行感官評定。

2 結(jié)果與分析

2.1 強化大曲感官評價結(jié)果

對對照大曲（圖1A）、噴灑強化大曲（圖1B）及混料強化大曲（圖1C）進行觀察。對照大曲曲皮已干，曲塊表面灰白色，“穿衣”一般，曲皮較薄，有輕微水圈出現(xiàn)；噴灑扣囊復膜孢酵母CICC 33077的大曲曲塊表面長滿白色菌斑（扣囊復膜孢酵母）且分布均勻，曲皮較??；內(nèi)部混料扣囊復膜孢酵母CICC 33077的大曲曲塊光面“穿衣”較好且均勻，粗糙面白色菌斑（扣囊復膜孢酵母）較密集，曲皮較薄。綜合強化大曲與對照大曲的表面形態(tài)（表3），得出結(jié)論，經(jīng)扣囊復膜孢酵母CICC 33077強化的大曲在感官指標方面明顯優(yōu)于對照大曲。

2.2 強化大曲微生物測定結(jié)果

強化大曲微生物測定結(jié)果表明，挑取的菌落均為扣囊復膜孢酵母，強化大曲中扣囊復膜孢酵母數(shù)量顯著增加，達到107cfu/g，顯著高于對照大曲（表4），結(jié)果與感官評價中強化大曲表面白菌斑增多一致。

2.3 強化大曲內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析

利用掃描電鏡對接種扣囊復膜孢酵母CICC 33077的強化大曲和對照大曲的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行解析，結(jié)果表明，對照大曲結(jié)構(gòu)致密，淀粉顆粒排列整齊，分布均勻，觀察到的微生物和菌絲體數(shù)量少（圖2中A、D）；而經(jīng)扣囊復膜孢酵母CICC 33077強化的大曲，無論采用表面噴灑方式還是內(nèi)部混料方式，大曲結(jié)構(gòu)疏松，淀粉顆粒排列松散，分布不均勻，微生物數(shù)量較多，大量菌絲體生長（圖2中B、C、E、F）；與微生物測定結(jié)果一致。

圖1 高溫大曲表面形態(tài)

扣囊復膜孢酵母CICC 33077能夠產(chǎn)生發(fā)達菌絲，強化大曲中該菌大量增殖，產(chǎn)生發(fā)達的菌絲體支撐起了大曲的整個骨架，致使大曲結(jié)構(gòu)縫隙變大，同時，其產(chǎn)生的淀粉酶水解大曲原料，使淀粉顆粒排列松散，進一步疏松了大曲的質(zhì)地，這均利于大曲中其他微生物的生長和曲心水分的輸送，避免了水圈的生成，與感官評價中對照大曲表面有水圈出現(xiàn)，強化大曲表面無水圈出現(xiàn)的結(jié)果一致。

表3 高溫大曲感官評價結(jié)果

表4 高溫大曲中扣囊復膜孢酵母計數(shù)結(jié)果

2.4 強化大曲理化指標測定結(jié)果

大曲理化指標測定結(jié)果顯示，水分和酸度在強化大曲和對照大曲間無明顯變化，而糖化力與液化力顯著提高，其中表面噴灑扣囊復膜孢酵母CICC 33077的大曲糖化力和液化力分別為1361 mg·G/g·h和5.6 g淀粉/g·h，分別提高了16.9%和47.3%；內(nèi)部混料接種扣囊復膜孢酵母CICC 33077的大曲的糖化力和液化力分別為1301 mg·G/g·h和4.6 g淀粉/g·h，分別提高了11.7%和21.1%；均顯著高于對照大曲（表5），與扣囊復膜孢酵母CICC 33077淀粉酶活力高的特征一致。同時，強化大曲發(fā)酵力分別達到1.38 g/100 g（噴灑大曲）和1.23 g/100 g（混料大曲），高于對照大曲，顯示出良好的發(fā)酵能力。此外，在對強化大曲淀粉含量的測定中發(fā)現(xiàn)，本研究采用傳統(tǒng)的酸水解法[14-15]不能反映大曲淀粉含量的真實情況；扣囊復膜孢酵母CICC 33077自身能夠分泌淀粉酶水解淀粉，使大曲中還原糖大量增加，以還原糖含量折算成淀粉含量進行表征會對測定結(jié)果產(chǎn)生極大干擾，而直接以還原糖含量來表征大曲淀粉含量對本研究來說更具有可信度與說服力。強化大曲的還原糖含量分別為4.40%（噴灑大曲）和3.15%（混料大曲），與對照大曲相比，還原糖含量顯著增加（見表5），這說明強化大曲中扣囊復膜孢酵母大量增殖并分泌淀粉酶降解原料，致使淀粉含量減少，還原糖含量增加；與強化大曲微生物指標測定結(jié)果和內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析結(jié)果具有一致性。

圖2 高溫大曲內(nèi)部結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖

表5 高溫大曲理化指標測定結(jié)果

大曲理化指標測定結(jié)果表明，扣囊復膜孢酵母CICC 33077微生物強化技術(shù)顯著的提高了大曲的淀粉降解能力和發(fā)酵能力，這有利于提高原料利用率，增加出酒率。結(jié)合感官指標對強化大曲與對照大曲進行綜合評定，結(jié)果顯示，表面噴灑和內(nèi)部混料接種扣囊復膜孢酵母CICC 33077的強化大曲在得分上均高于對照大曲（見表6），其中噴灑大曲被評定為優(yōu)級曲，混料大曲被評定為一級曲，對照大曲僅為二級曲；這表明扣囊復膜孢酵母CICC 33077的強化能夠改善高溫大曲的品質(zhì)，提高優(yōu)級曲產(chǎn)率，有利于后續(xù)芝麻香型白酒的生產(chǎn)。

表6 高溫大曲綜合評定結(jié)果

2.5 強化大曲發(fā)酵實驗結(jié)果

從色澤、香氣和口味三方面對發(fā)酵酒液進行綜合評定，評定結(jié)果顯示，強化大曲釀造的酒液色澤透明，香氣濃郁，醇甜爽凈，香氣愉悅程度和酒樣干凈度均優(yōu)于對照大曲（表7）。此外，噴灑強化大曲發(fā)酵得到的酒液的酒精度為45.2%vol，相較于對照大曲提高了6.4%，混料強化大曲和對照大曲發(fā)酵得到的酒液在酒精度上無明顯區(qū)別。

表7 高溫大曲發(fā)酵酒樣的感官評定

3 討論

扣囊復膜孢酵母能夠分泌淀粉酶[16-17]、蛋白酶[18]及β-葡萄糖苷酶[19]，同時能夠產(chǎn)生海藻糖[20]，在食品、發(fā)酵、制藥及乙醇生產(chǎn)行業(yè)均具有很大的應(yīng)用價值[21-24]。本研究將分離篩選得到的扣囊復膜孢酵母應(yīng)用于白酒釀造，利用微生物強化技術(shù)，通過不同方式將具有較高產(chǎn)淀粉酶活力的菌株扣囊復膜孢酵母CICC 33077添加到芝麻香型白酒高溫大曲生產(chǎn)過程中，取得了良好的效果。

扣囊復膜孢酵母CICC 33077具有較強產(chǎn)淀粉酶能力，淀粉酶活力達到12000 U/g，酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH值為4.0，適合大曲發(fā)酵環(huán)境。將該菌株應(yīng)用于大曲生產(chǎn)，顯著的提高了大曲原料中淀粉的降解能力，強化大曲糖化力與液化力分別提高了16.9%和47.3%，淀粉降解產(chǎn)物還原糖含量顯著增加，大曲原料利用率提高。同時，大曲綜合評定結(jié)果表明，強化大曲達到優(yōu)級曲和一級曲水平；發(fā)酵酒色澤透明，香氣濃郁，醇甜爽凈，品質(zhì)得到極大改善。此外，我們對兩種強化方式進行了比較，結(jié)果表明噴灑強化方式制備得到的大曲在糖化力、液化力、發(fā)酵力、品質(zhì)等級等方面均優(yōu)于混料大曲，更加適合應(yīng)用于高溫大曲的生產(chǎn)過程。

本研究首次將掃描電鏡技術(shù)[25]應(yīng)用于大曲內(nèi)部結(jié)構(gòu)的解析，動態(tài)監(jiān)測大曲內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，再結(jié)合大曲微生物指標、感官指標、理化指標的測定，建立了芝麻香型白酒高溫大曲動態(tài)監(jiān)測模型，直觀地反映了扣囊復膜孢酵母CICC 33077對大曲品質(zhì)的促進作用。高產(chǎn)淀粉酶菌株扣囊復膜孢酵母CICC 33077的強化能夠高效降解大曲中的淀粉顆粒，既能產(chǎn)生大量小分子糖，參與到美拉德反應(yīng)中，生成白酒風味成分或前體物質(zhì)，豐富大曲風味，又能使大曲內(nèi)部縫隙增大，避免曲塊板結(jié)；同時該菌株產(chǎn)生的發(fā)達菌絲體能夠進一步疏松大曲結(jié)構(gòu)，重構(gòu)大曲內(nèi)部骨架，利于吸收并引導出大曲中心部位的水分，減少大曲“壞心”、脹裂的概率，利于其他微生物的生長繁殖，起到促進大曲微生物群落結(jié)構(gòu)更替的作用。目前，有關(guān)扣囊復膜孢酵母對大曲微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究仍在進行中。本研究將扣囊復膜孢酵母CICC 33077實際應(yīng)用于大曲生產(chǎn)，并通過多種方式對強化大曲進行分析評價，不僅展現(xiàn)了該菌株在釀酒行業(yè)的應(yīng)用潛力，同時發(fā)展了大曲評價體系，可為其他優(yōu)勢功能性菌株在高溫大曲中的應(yīng)用起到良好的示范作用。