王首人,李嗣生,李寧陽*,喬旭光,遲雪文,畢艷紅

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018

2.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江蘇 淮安 223003

黑蒜又稱發(fā)酵黑蒜，是用新鮮大蒜，在恒溫恒濕發(fā)酵箱里發(fā)酵60～90 d后制得的大蒜深加工產(chǎn)品，能夠保留大蒜部分原有成份，并且黑蒜中的微量元素含量提高，口味酸甜，無大蒜辛辣味[1]。其由日本人1997年發(fā)明，并于2007年申請(qǐng)專利。黑蒜具有較強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)還保留了大蒜原有的部分功效成分。黑蒜多酚含量、過氧化氫活性清除能力以及超氧化物歧化酶（SOD）的活性，比新鮮大蒜分別增加了7倍、10倍、13倍[2-4]。黑蒜具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)免疫功能[5]，其對(duì)降低丙二醛的含量和提高GSH-Px的活性方面與鮮蒜相比有明顯的優(yōu)勢(shì)[6]。與鮮蒜相較，黑蒜在加工過程中大蒜的大分子多糖和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子低聚糖和氨基酸，更有利于人體快速地吸收和轉(zhuǎn)化。其微量元素含量較高，諸如鍺、硒等和糖蛋白等活性成分對(duì)機(jī)體免疫能力的提高、延緩衰老、遠(yuǎn)離亞健康都可以起到較好的緩解作用[7-11]，適合便秘、三高（高血脂、高血糖、高血壓）以及癌癥人群。黑蒜口味酸甜，食后無大蒜原有臭味，不上火，是速效性的保健食品，逐漸受到人們的喜愛。多酚類物質(zhì)主要具有強(qiáng)抗氧化作用，還有預(yù)防心血管疾病、預(yù)防老年性病變、防輻射、抗腫瘤、抗病毒等作用，被稱為“第七類營(yíng)養(yǎng)素”。黑蒜中的多酚比鮮蒜高出約5倍，其中的巰基和親電子基團(tuán)能夠清除氧和自由基的作用。黑蒜中的總酚類物質(zhì)的抗氧化活性優(yōu)于維生素C和維生素E，目前對(duì)于該類物質(zhì)改性的研究較多，但改性過程中對(duì)本體物質(zhì)損失較大，與改性前的對(duì)比研究較少，缺少定量數(shù)據(jù)，改性成本與效果之間的關(guān)系將是下一步研究的重點(diǎn)[12]。黑蒜抗氧化活性小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黑蒜可以降低自由基對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷，提高體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高肝臟組織中SOD以及組織中GSH-Px的活性，起到延緩衰老的作用[13]。

目前植物多酚的提取方法主要有溶劑萃取法、超聲波提取和微波輔助提取、超臨界萃取和高壓快速提取等。純化方法主要有常規(guī)柱色譜、HPLC半制備色譜、高速逆流色譜法等[14]。總之，對(duì)天然多酚的研究還處于初級(jí)階段，分離制備多酚的方法將成為下一步研究的重點(diǎn)。

本文通過采用正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)超聲輔助提取黑蒜中的總酚類物質(zhì)進(jìn)行工藝優(yōu)化，并對(duì)鮮蒜和黑蒜中的總酚提取物的體外抗氧化性進(jìn)行了全面的比較研究，以期為延伸大蒜深加工產(chǎn)業(yè)鏈，為黑蒜保健產(chǎn)品的開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

鮮蒜，購于山東萊蕪；黑蒜，實(shí)驗(yàn)室自制（取新鮮、無蟲蛀、蒜皮完整的鮮蒜在溫度80℃，濕度75%的恒溫恒濕箱內(nèi)加工大約15 d，制得黑蒜，其水分含量40%左右，顏色黑褐色，味道酸甜）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

沒食子酸、乙酸乙酯，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；福林酚，分析純，Solarbio；抗超氧陰離子測(cè)試盒、羥自由基測(cè)定試劑盒，均購自南京建成生物科技有限公司；DPPH，ABTS試劑盒，均為美國sigma-Aldrich公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

KQ300VDV，三頻數(shù)控超聲波清洗器，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；RE-600AT旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海予華儀器設(shè)備有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；HC2168高速組織搗碎機(jī)上海賽康電器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總酚含量的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法[12]，將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次按照0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL取樣，測(cè)定其吸光值，并以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 黑蒜總酚超聲輔助提取單因素試驗(yàn)

1.4.2.1 液料比對(duì)黑蒜總酚提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品多份，在超聲功率100 W條件下，分別以液料比（v/w）為4:1，5:1，6:1，7:1，8:1，9:1在條件為80℃的操作條件下超聲提取40 min，測(cè)定總酚含量，每組樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.4.2.2 提取溫度對(duì)黑蒜總酚提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品多份，在條件為超聲功率100 W下，以5:1的液料比（v/w）分別在50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下超聲輔助提取40 min，測(cè)定其總酚含量，每組樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.4.2.3 提取時(shí)間對(duì)黑蒜總酚提取率的影響 準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品多份，在條件為超聲功率100 W下，以5:1的液料比（v/w）在80℃的溫度條件下依次進(jìn)行10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，60 min，70 min，80 min提取，分別測(cè)定其總酚含量，每組樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.4.3 黑蒜總酚超聲輔助提取條件優(yōu)化 選取提取時(shí)間、提取溫度、液料比作為總酚提取的主要影響因素，設(shè)計(jì)L9（33）正交實(shí)驗(yàn)，篩選出超聲輔助提取總酚的最優(yōu)工藝條件。

1.4.4 體外抗氧化能力測(cè)定方法 取等量鮮蒜、黑蒜按照同樣的提取方法進(jìn)行提取總酚，得到鮮蒜、黑蒜待測(cè)樣品。

1.4.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 將精確配置的系列濃度梯度的鮮蒜、黑蒜樣液分別加入試管中，后向各試管中加入一定量DPPH乙醇溶液，在避光的條件下充分混合，經(jīng)37℃恒溫水浴1 h后，測(cè)定其在517 nm處的吸光值，取蒸餾水為空白對(duì)照組。

式中：Ab—對(duì)照液吸光值；AS—測(cè)定樣液吸光值。

式中：Ab—對(duì)照液吸光值；AS—測(cè)定樣液吸光值。

式中：Ab—對(duì)照液吸光值；AS—測(cè)定樣液吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

以上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次，取平均值，運(yùn)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性分析，使用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取黑蒜總酚的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.2 不同液料比對(duì)黑蒜總酚提取量的影響 結(jié)果如圖1所示，隨著液料比的加大，黑蒜總酚提取量也隨之上升，這是由于提取溶劑的用量增加，分子熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，溶質(zhì)和溶劑的接觸機(jī)會(huì)增強(qiáng)、從而增大了溶劑和溶質(zhì)的接觸面積，減小了溶質(zhì)和溶劑的傳質(zhì)阻力和擴(kuò)散距離，這樣有利用黑蒜總酚的溶出。當(dāng)液料比高于5:1時(shí)，提取曲線呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于液料比的增加，雜質(zhì)被溶解，提取效果降低[15]，因此最佳的提取液的液料比為4:1到6:1。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑蒜總酚提取量的影響 圖2可以看出，在提取時(shí)間逐漸增加的過程中，黑蒜的總酚提取量得變化趨勢(shì)是先上升后下降。原因可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黑蒜總酚在長(zhǎng)時(shí)間的溶劑體系中可能部分會(huì)降解，同時(shí)也可能會(huì)導(dǎo)致黑蒜中的部分雜質(zhì)溶于提取溶劑，從而使測(cè)定樣品中黑蒜的總酚含量產(chǎn)生下降的趨勢(shì)。因此確定黑蒜總酚高效提取時(shí)間為30～50 min為宜。

2.1.4 提取溫度對(duì)黑蒜總酚含量的影響 由圖3可以看出，隨著提取溫度的不斷升高，黑蒜總酚的提取量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，圖中顯示溫度在80℃時(shí)黑蒜總酚的提取量達(dá)到最高。在溫度為80℃之前，隨著溫度的升高，提取體系分子的熱運(yùn)動(dòng)不斷增強(qiáng)，黑蒜總酚不斷溶出，提取體系中氣泡不斷增多，這樣可促進(jìn)提取體系發(fā)生汽化；當(dāng)提取溫度高于80℃，提取體系的蒸汽壓不斷增強(qiáng)，這樣可以使體系中的氣泡在閉合的過程中加大了緩沖，從而可進(jìn)一步消弱提取體系的汽化作用[16]。所以，根據(jù)分析可確定黑蒜總酚最佳的提取溫度為70～90℃。

圖1 不同液料比對(duì)黑蒜總酚提取量的影響Fig.1 Effect of different liquid and solid ratio on total phenol extraction in black garlic

圖2 提取時(shí)間對(duì)黑蒜總酚提取量的影響Fig.2Effect of extraction time on total phenol extraction in black garlic

圖3 提取溫度對(duì)黑蒜總酚量的影響Fig.3Effect of extraction temperature on total phenol extraction in black garlic

2.2 超聲輔助提取黑蒜總酚工藝的優(yōu)化

通過對(duì)黑蒜總酚提取單因素結(jié)果的分析，可確定不同液料比、提取溫度、提取時(shí)間為黑蒜總酚提取的關(guān)鍵決定因素，所以以該三個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)三水平三因素實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平如表1，所得正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 黑蒜總酚乙醇提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment on ethanol extraction of total phenol in black garlic

通過表2分析，選取的三個(gè)因素對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的貢獻(xiàn)大小是：B＞C＞A，即提取溫度＞提取時(shí)間＞液料比。通過表2的分析數(shù)據(jù)可得，理論上的最優(yōu)正交組合為A2B2C3，即液料比為5:1，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為50 min。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)最優(yōu)組合的A2B2C3的5號(hào)實(shí)驗(yàn)的黑蒜總酚提取量為最大，所以說理論上的最優(yōu)正交組合和實(shí)際實(shí)驗(yàn)最佳提取結(jié)果相符，因此可確定黑蒜總酚提取的最佳條件為：液料比為5:1，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為50 min，該條件下提取黑蒜總酚的含量為2306.8μg/g。

2.3 鮮蒜、黑蒜提取液的體外抗氧化能力

2.3.1 DPPH自由基清除能力 圖4顯示，當(dāng)樣品濃度的逐漸增加時(shí)，兩種蒜樣品的總酚提取物的DPPH自由基清除能力均有所增加，黑蒜上升的幅度較為明顯。相同樣品濃度下，黑蒜中總酚提取物的DPPH自由基清除能力約為鮮蒜的4～9倍。

2.3.2 ABTS自由基清除能力 溶液會(huì)在抗氧化劑與ABTS自由基發(fā)生反應(yīng)后褪色，導(dǎo)致特征吸光度降低。試驗(yàn)證明，吸光度值與抗氧化能力呈負(fù)相關(guān)。吸光度的值越低，所檢測(cè)物質(zhì)的總抗氧化能力也就越強(qiáng)[17]。圖5表明，在同等條件下，黑蒜總酚提取物對(duì)ABTS自由基清除能力約為鮮蒜的10倍。

圖4 鮮蒜與黑蒜總酚提取物對(duì)DPPH自由基清除能力比較Fig.4Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on DPPH free radical

圖5 鮮蒜與黑蒜總酚提取物對(duì)ABTS自由基清除能力比較Fig.5 Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on ABTS free radical

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子清除能力也隨樣品濃度的增加而顯著提高。濃度較低時(shí)上升幅度較大，在18.1 μg/mL時(shí)趨于平緩，這可能與浸出硒元素含量增加緩慢有關(guān)[18]。在黑蒜樣品濃度為36.2 μg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基清除率可達(dá)46.8%。將鮮蒜總酚提取物與黑蒜超氧陰離子自由基清除能力對(duì)比，由圖6可知相同條件下，黑蒜對(duì)超氧陰離子的清除能力約為鮮蒜的3倍。

2.3.4 羥自由基清除能力 黑蒜中含有較多自由基清除能力強(qiáng)的生物活性成分，可清除羥基自由基，抑制由親水基團(tuán)APPH引起的氧化反應(yīng)。從圖7可以看出，兩種樣品對(duì)·OH清除率的影響為黑蒜總酚提取物＞鮮蒜總酚提取物。在質(zhì)量濃度為14.48 μg/mL時(shí)，黑蒜總酚提取物對(duì)·OH清除率可達(dá)到88.08%，此時(shí)其對(duì)羥自由基的清除率是鮮蒜的15倍。這可能是因?yàn)楹谒饪偡犹崛∥镏泻休^多的水溶性硒蛋白，可以有效的清除羥自由基[19]。

圖6 鮮蒜與黑蒜總酚提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除能力比較Fig.6 Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on superoxide anion free radical

圖7 鮮蒜與黑蒜總酚提取物對(duì)羥自由基的清除能力比較Fig.7 Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on hydroxy radical

3 結(jié) 論

（1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在超聲功率100 W，提取溶劑為80%乙醇的條件下，影響超聲輔助提取黑蒜總酚的主要因素是提取溫度，優(yōu)化得到的工藝條件為提取溫度80℃，液料比5:1，提取時(shí)間為50 min，在該條件下，有效成分含量達(dá)到最高，得到的總酚含量為2306.8μg/g。

（2）通過比較黑蒜和鮮蒜中總酚提取物的體外抗氧化能力，黑蒜總酚提取物的DPPH自由基、ABTS自由基、超氧陰離子及羥自由基清除能力均高于鮮蒜，因此黑蒜更適于藥用和保健品的開發(fā)。