江 敏 王 菲 易志健 喻學(xué)鋒 黃逸凡 周文華 朱劍豪

1(深圳市中科摩方科技有限公司 深圳 518114)2(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所 深圳 518055)

1 引 言

核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)廣泛存在于各種環(huán)境中，在人和動物的唾液、汗液和血液中均可常見。它是由數(shù)個半胱胺酸基組成一類結(jié)構(gòu)緊湊、體積較小的蛋白質(zhì)。其中，半胱胺酸基之間采用二硫鍵連接形成[1]，這種結(jié)構(gòu)方式使得變性的核糖核酸酶容易在室溫下恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)，難以被滅活。同時，核糖核酸酶具有很強的生物學(xué)活性，容易使核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)分解，對實驗結(jié)果造成干擾，尤其是 RNA 提取實驗。如何有效去除核糖核酸酶污染已成為實驗室污染亟待解決的一個難題。目前，去除核糖核酸酶的常用方法有：焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡[1]、高溫高壓滅菌和RNase 抑制劑。然而，焦碳酸二乙酯是高活性烷化試劑，對人體有害且存在致癌風險；高溫高壓滅菌和 RNase 抑制劑不能使核糖核酸酶完全滅活。

低溫等離子體因其含有大量高能電子、自由基和激發(fā)態(tài)原子等活性粒子，備受關(guān)注與研究。大量研究表明低溫等離子體能夠有效破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。Segat 等[2]利用低溫等離子體對乳清分離蛋白溶液進行處理，發(fā)現(xiàn)作用 15 min 后，蛋白質(zhì)全部發(fā)生了氧化。Kim[3]研究了氦氣/氧氣低溫等離子體處理生物分子效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)活性氧自由基對細胞內(nèi)多肽、DNA 和酶蛋白具有損傷作用。Deng 等[4]利用激光誘導(dǎo)技術(shù)從放電電壓、氧氣流量等方面研究氦氣/氧氣等離子體滅活蛋白的機制。Jijie 等[5]以牛血清蛋白為模型研究了氦等離子體射流對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。Takai 等[6]以溶菌霉為蛋白模型研究了等離子體對蛋白功能的影響。Topala 和 Nagatsu[7]用氦等離子體射流處理牛血清蛋白和游離蛋氨酸發(fā)現(xiàn)它們極易被等離子體氧化。Lackmann 等[8]用蛋白和 DNA 模型來研究污水中等離子體滅菌的機理。陳緒松等[9]利用蛋白含量測定和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)分析了經(jīng)等離子體射流處理過的牛血清蛋白，結(jié)果推測等離子體產(chǎn)生的活性成份可使牛血清蛋白變性或斷裂成片段。Lackmann 等[10]以牛血清蛋白為模型研究，從拉曼光譜測得的等離子體射流能夠氧化酪氨酸殘基和含硫氨基酸，但半膀氨酸沒有明顯的氧化現(xiàn)象。Lackmann等[11]利用雙介質(zhì)阻擋放電(Dielectric Barrier Discharge，DBD)裝置產(chǎn)生的氦氣/氧氣等離子體射流對 RNase 進行處理，實驗結(jié)果表明其對RNase 具有顯著的滅活效果。然而，等離子體滅活效果受到作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)等因素的影響，目前尚不清楚其他作用氣體類型對RNase 的滅活效果，且 DBD 射流因結(jié)構(gòu)的限制，在實際應(yīng)用中難以實現(xiàn)大面積、高效的滅活效果。

針對上述存在的問題，本文主要探討低溫等離子體技術(shù)在核糖核酸酶滅活的應(yīng)用，并分析了等離子體活性粒子密度的兩個關(guān)鍵影響因素(作用氣體類型和等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu))對核糖核酸酶滅活效果的影響。旨在確定等離子體滅活核糖核酸酶最佳作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)，為等離子體技術(shù)在實驗室污染處理領(lǐng)域應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

2 實驗方法

2.1 實驗裝置

本文主要采用了雙介質(zhì)阻擋放電裝置、懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電(Floating-Electrode Dielectric Barrier Discharge，F(xiàn)E-DBD)裝置和表面介質(zhì)阻擋放電(Surface Dielectric Barrier Discharge，SDBD)裝置對核糖核酸酶進行滅活研究：前者用于探討不同作用氣體對核糖核酸酶活性的影響；后兩者(可大面積處理的等離子體發(fā)生器)用于探討等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶活性的影響。文中所涉及的放電裝置如圖1所示。其中，雙介質(zhì)阻擋放電裝置的高壓電極為直徑 2 mm 的銅棒，內(nèi)介質(zhì)為內(nèi)徑 2 mm、外徑 4 mm 的石英管，外介質(zhì)為 2 mL 的石英針筒。懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置則采用直徑為 30 mm、厚度為 0.5 mm 的圓形銅板作為高壓電極，并將其置于外徑為 35 mm的聚四氟乙烯中。而表面介質(zhì)阻擋放電裝置則采用厚度為 2 mm 的陶瓷片作為阻擋介質(zhì)，厚度為0.2 mm 的銅片作為正負極并粘附在陶瓷片兩側(cè)，形成導(dǎo)電體-阻擋介質(zhì)-導(dǎo)電體結(jié)構(gòu)。在本文中，采用南京蘇曼的 CTP-2000K 低溫等離子體實驗電源，放電電壓檢測采用 Tektronix P6015A 高壓探頭，示波器采用 Tektronix TBS1102。

圖1 低溫等離子體裝置示意圖Fig. 1 Schematic of cold temperature plasma generators

2.2 作用氣體

作用氣體對放電電壓、等離子體成份種類及密度等具有關(guān)鍵的影響作用。在本文中，雙介質(zhì)阻擋放電裝置采用的作用氣體氬氣(Ar)、氦氣(He)和氧氣(O2)均為高純度氣體，純度為99.99%。而惰性氣體/水汽的混合氣體則是利用惰性氣體(氬氣或氦氣)通入水溶液而獲得。懸浮式電極介質(zhì)阻擋放電裝置和表面介質(zhì)阻擋放電裝置則直接采用空氣作為作用氣體。

2.3 核糖核酸酶類型

核糖核酸酶類型繁多，本研究主要以穩(wěn)定性強、最難滅活的核糖核酸酶 A 作為處理對象。核糖核酸酶 A 來源于牛胰腺，屬于核糖核酸內(nèi)切酶，由 124 個氨基酸殘基和 4 對分子內(nèi)的二硫化鍵組成。本實驗中的核糖核酸酶 A 購自 Sangon Biotech 公司的 B500474 核糖核酸酶 A 溶液，濃度為 10 mg/mL。

2.4 熒光探針

本文采用熒光法來檢測核糖核酸酶的活性。選用的熒光試劑為 6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA，是一種實驗室常用的 RNase 探針，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示[12]，發(fā)射波長為 490 nm，激發(fā)波長為 520 nm。當其與核糖核酸酶混合時，P1 基團上的 P—O 鍵容易被酶剪切斷裂成6-FAM(6-羧基熒光素)和 6-TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)。酶的活性越強，P—O 鍵被剪切速度越快，產(chǎn)物 6-FAM 含量越多，熒光強度上升的速率則越快。因此，通過熒光強度變化曲率可以判斷核糖核酸酶的活性。

圖2 熒光試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)[12]Fig. 2 Chemical structure of fluorescent reagents[12]

2.5 實驗步驟

(1)將 10 mg/mL 的核糖核酸酶 A 溶液分散在pH 7.5 的 Tris·HCl/NaCl 緩沖溶液中稀釋制得待處理溶液。其中，利用雙介質(zhì)阻擋放電裝置處理的待處理溶液濃度為 0.1 μg/mL，利用懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置和表面介質(zhì)阻擋介質(zhì)放電裝置處理的待處理溶液濃度均為 10 μg/mL。

(2)取 30 μL 濃度為 0.1 μg/mL 的待處理液放置于 200 μL 離心管中，取 10 μL 濃度為 10 μg/mL的待處理液放置于經(jīng)滅菌無酶的 2 cm×2 cm 蓋玻片中干燥待用。

(3)將上述(2)中含 0.1 μg/mL 核糖核酸酶 A溶液的離心管移至雙介質(zhì)阻擋放電裝置噴嘴下方，調(diào)整液面與噴嘴的距離為 15 mm，設(shè)置放電電壓為 12 kV，按設(shè)定時間進行處理。

(4)取上述(2)中含有核糖核酸酶 A 溶液的蓋玻片放置于無菌玻璃片上，調(diào)整懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置放電面與蓋玻片的距離為 3 mm，設(shè)置放電電壓為 12 kV。按設(shè)定時間處理后將蓋玻片放置于含有 10 mL pH 7.5 的 Tris·HCl/NaCl 緩沖溶液的離心管進行浸泡，使蓋玻片上的核糖核酸酶 A 溶液充分分散在緩沖液中。

(5)取上述(2)中含有核糖核酸酶 A 溶液的蓋玻片并用夾子夾持，調(diào)整表面介質(zhì)阻擋放電裝置放電面與蓋玻片的距離為 1 mm，設(shè)置放電電壓為 12 kV。按設(shè)定時間處理后將蓋玻片放置于含有 10 mL pH 7.5 的 Tris·HCl/NaCl 緩沖溶液的離心管進行浸泡，使蓋玻片上的核糖核酸酶 A 溶液充分分散在緩沖液中。

(6)取 20 μL 上述(3)、(4)和(5)中的核糖核酸酶 A 溶液，將其加到 6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA 熒光探針中，使用日立 F-4600 熒光分光光度計測得熒光強度，以此判斷核糖核酸酶 A 的活性。

3 結(jié)果與討論

3.1 作用氣體類型對核糖核酸酶 A 活性的影響

低溫等離子體中含有大量的自由基、活性基團、帶電粒子等，能夠有效地破壞核糖核酸酶的二硫化鍵結(jié)構(gòu)，使得酶蛋白發(fā)生變性引起失活[11]。低溫等離子體處理核糖核酸酶的效率主要取決于自由基、活性粒子等成份的濃度。

由圖3 可以看出，雙介質(zhì)阻擋放電裝置產(chǎn)生的等離子體射流對核糖核酸酶 A 溶液具有明顯的滅活作用。從熒光強度上升的速率可以看出，處理時間為 1 min 時，核糖核酸酶 A 出現(xiàn)失活或活性降低現(xiàn)象。隨著作用時間的增加，熒光強度上升速率呈逐漸降低趨勢，這是由于隨著作用時間的增加，大量的酶已經(jīng)失活或活性降低，導(dǎo)致其剪切熒光探針上 P—O 鍵的效率也降低。對比圖3(a)、(c)、(e)和(b)、(d)、(f)可以得出，作用氣體中含氦氣產(chǎn)生的等離子體滅活核糖核酸酶 A 的效果優(yōu)于含氬氣，作用 5 min 基本可完全滅活。這是由于氦氣放電初始電壓低于氬氣，在相同的放電電壓下，氦氣等離子體產(chǎn)生的活性粒子密度比較高。此外，由圖3 還可以看出，作用氣體中混有氧氣或者水汽的滅活效果優(yōu)于單一惰性氣體。這是因為相對作用單一惰性氣體而言，作用氣體中含有氧氣或水汽，產(chǎn)生的等離子體中含有較高濃度的活性氧粒子、羥基等功能團，能夠更高效地破壞核糖核酸酶 A 結(jié)構(gòu)上的 4 對二硫化鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破損，從而使其失活。

3.2 等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶 A 活性的影響

低溫等離子體的成份種類及濃度不僅受到作用氣體類型的影響，同時也會受到發(fā)生器結(jié)構(gòu)的限制。考慮實際應(yīng)用的需求，本文探討了兩種可實現(xiàn)大面積處理的懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置(FE-DBD)和表面介質(zhì)阻擋放電裝置(SDBD)對核糖核酸酶 A 滅活的影響。

由圖4可以看出，F(xiàn)E-DBD 和 SDBD 兩種等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶 A 均具有明顯的滅活作用。FE-DBD 等離子體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的等離子體處理 3 min 后，測得熒光強度沒有明顯的變化，說明核糖核酸酶 A 已經(jīng)失活；而 SDBD 等離子體結(jié)構(gòu)則需要處理 5 min。在相同放電電壓和作用時間條件下，F(xiàn)E-DBD 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的等離子體滅活核糖核酸酶 A 的效果優(yōu)于 SDBD 結(jié)構(gòu)。

4 與國內(nèi)外相似研究對比分析

核糖核酸酶性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱、耐酸、耐堿，且具有強的生物學(xué)活性，很容易使 RNA 分解，這不僅容易造成實驗室生物污染，同時在一定程度上限制了分子生物技術(shù)——聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)的發(fā)展。然而針對核糖核酸酶去除的研究比較少。曹文俊等[13]利用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡去除樣品的核糖核酸酶。熊毅等[14]利用氧釩核糖核苷復(fù)合物(RVC)抑制核糖核酸酶的活性，發(fā)現(xiàn)濃度為 10 mmol/L 的 RVC可以抑制 40 μg 核糖核酸酶。而 Lackmann 等[11]利用 DBD 等離子體對核糖核酸酶進行滅活作用，結(jié)果表明，等離子體對核糖核酸酶水溶液作用 30 s 后活性降低 50% 以上，作用 300 s 后酶基本失活。對比現(xiàn)有研究，本文主要對大氣壓低溫等離子體滅活核糖核酸酶的影響參數(shù)展開研究，分析了作用氣體類型和等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶 A 滅活的影響。實驗結(jié)果表明，混有氧氣或水汽的作用氣體滅活效果優(yōu)異于單一惰性氣體，且 FE-DBD 等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)滅活效果較佳，作用 3 min 即可完全滅活核糖核酸酶 A。

5 結(jié)論與展望

本文主要從作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)兩個方面研究了大氣壓低溫等離子體對核糖核酸酶 A滅活的影響。結(jié)果表明，大氣壓低溫等離子體能夠有效滅活核糖核酸酶 A，且作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)對滅活效果起著重要影響作用。作用氣體中混有氧氣或水汽能夠明顯增強核糖核酸酶 A的滅活能力。相對于 SDBD 等離子體發(fā)生器，F(xiàn)E-DBD 等離子體發(fā)生器產(chǎn)生的等離子體對核糖核酸酶 A 的滅活效果更佳。

核糖核酸酶污染是目前實驗室潔凈面臨的重要挑戰(zhàn)之一，雖然已有相關(guān)研究證明等離子體技術(shù)能夠有效地滅活核糖核酸酶，但主要是針對酶溶液處理。如何將等離子體技術(shù)切實應(yīng)用到實驗室酶污染體滅活是后續(xù)推廣重點考慮的方向，如酶污染槍頭、酶污染實驗臺等滅活，等離子體大面積滅活酶相關(guān)儀器的開發(fā)和設(shè)計等。