譚宇亭，劉蘭，廖蕓茜，張攀，徐穎

隨著兒科手術(shù)的發(fā)展及兒童醫(yī)療檢查的需求，嬰幼兒全身麻醉(簡(jiǎn)稱全麻)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[1]。七氟烷(sevoflurane，SEVO)是一種新型吸入麻醉藥，因其誘導(dǎo)和蘇醒平穩(wěn)而迅速，對(duì)氣道刺激性較小，麻醉深度容易調(diào)節(jié)，對(duì)循環(huán)系統(tǒng)影響小，是小兒全麻誘導(dǎo)和維持的理想吸入麻醉藥。但是大量研究證據(jù)表明，七氟烷對(duì)發(fā)育期的神經(jīng)系統(tǒng)有一定的毒性作用[2-3]，而對(duì)嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是否有長(zhǎng)期影響目前尚無(wú)定論。因此，嬰幼兒七氟烷麻醉對(duì)發(fā)育期大腦的影響是目前臨床關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種從花生、葡萄、藍(lán)莓中提取的非黃酮多酚類(lèi)化合物，具有很強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)[4]，能透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，表現(xiàn)出有效的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[5-7]。RES作為沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶Ⅰ(silent information adjustment factor 2 related enzyme Ⅰ，SIRT1)激動(dòng)劑，以其抗氧化性能廣泛作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，起神經(jīng)保護(hù)作用。目前，有關(guān)RES在保護(hù)腦缺血-再灌注損傷，預(yù)防神經(jīng)退行性疾病以及防止糖尿病神經(jīng)病變等方面的研究頗多[8-9]，但RES能否預(yù)防或治療七氟烷引起的發(fā)育期腦損傷，目前少有報(bào)道。本研究以新生SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用腹腔注射RES預(yù)處理，觀察七氟烷對(duì)于新生大鼠腦組織和認(rèn)知功能的影響，以及RES是否可以預(yù)防或治療由七氟烷引起的腦損傷及認(rèn)知功能改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 SPF級(jí)健康新生SD大鼠120只，平均體重9.28g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。RES購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，七氟烷購(gòu)自江蘇恒瑞制藥有限公司，SYBR Green購(gòu)自日本Takara公司，PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase，caspase 3)、SIRT1兔多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，β-actin小鼠單克隆抗體購(gòu)自浙江聯(lián)科生物有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購(gòu)自浙江聯(lián)科生物有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置及分析系統(tǒng)購(gòu)自北京碩林苑科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。SPF級(jí)健康6日齡SD大鼠120只，隨機(jī)分為對(duì)照組、RES組、SEVO組和SEVO+RES組，每組30只。采用自制的麻醉箱將SEVO組與SEVO+RES組暴露于2.5%的七氟烷環(huán)境中，每天2h，連續(xù)3d。對(duì)照組與RES組的暴露環(huán)境除七氟烷的使用以外，其余與前述各組處理相同。暴露時(shí)維持環(huán)境溫度為21～25℃，麻醉箱底部鋪有鈉石灰吸收CO2，同時(shí)使用數(shù)字測(cè)氧儀及麻醉機(jī)持續(xù)檢測(cè)氧濃度及七氟烷濃度。每次暴露前30min，各組根據(jù)處理的不同通過(guò)腹腔注射RES(30mg/kg，溶于0.5% DMSO)或等量的安慰劑(0.5% DMSO)預(yù)處理。每次暴露結(jié)束后，待新生鼠反射恢復(fù)，完全蘇醒后送回籠子與母鼠一起飼養(yǎng)，給予干凈充足的食物和水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在25±1℃，12h光照/黑暗循環(huán)(7:00-19:00)。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理 各組取20只新生鼠于最后一次暴露結(jié)束后(第8天，記為P8)在戊巴比妥鈉麻醉下處死，收集標(biāo)本。各組取4只采用心臟灌注4%多聚甲醛固定腦組織，用于HE染色。其余新生鼠均在戊巴比妥麻醉下直接斷頭，分離收集海馬組織。其中各組取6只新生鼠海馬組織用于Western blotting檢測(cè)caspase 3、SIRT1蛋白表達(dá)；各組取6只新生鼠海馬組織用于檢測(cè)SIRT1、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisomeproliferators activated receptor gamma co-activator 1 alpha，PGC-1α)、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子3α(forkhead box O3 alpha，F(xiàn)OXO3α)mRNA的表達(dá)；各組取4只新生鼠海馬組織用于檢測(cè)MDA、SOD的含量；各組取余下的10只新生鼠在最后一次暴露結(jié)束后送回籠子與母鼠一起飼養(yǎng)至第30天(P30)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 腦組織病理形態(tài)學(xué)變化 采用HE染色觀察。石蠟切片后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度濃度(100%、95%、85%、75%)水化，自來(lái)水沖洗后以蘇木素染色5min，自來(lái)水沖洗2min，1%鹽酸乙醇分色，碳酸鋰溶液返藍(lán)后自來(lái)水沖洗，0.5%伊紅染色30s，自來(lái)水沖洗后分別放入95%、100%的乙醇脫水1min，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，電子光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 SIRT1、PGC-1α、FOXO3α mRNA表達(dá)變化 采用RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。將各組海馬組織勻漿后按照Trizol法提取RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR反應(yīng)體系10μl：cDNA 1μl，上下游引物各0.4μl，SYBR Green 4.5μl，ddH2O 4.7μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃ 5s、63℃ 40s，共39個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2–ΔΔCt法計(jì)算。PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for PCR

1.2.5 SIRT1、Caspase 3蛋白水平檢測(cè) 采用Western blotting進(jìn)行檢測(cè)。大鼠斷頭迅速分離腦組織，在冰上取下完整海馬組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白后，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。各組蛋白調(diào)整濃度后經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST反復(fù)洗滌后，一抗(caspase 3，1:500；SIRT1，1:500；β-actin，1:5000)孵育過(guò)夜，TBST反復(fù)洗滌后室溫孵育二抗1h，條帶使用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.6 SOD、MDA蛋白水平檢測(cè) 將分離的完整海馬組織制備成10%勻漿液后，4℃條件下，3000r/min離心10min取上清液，使用BCA法測(cè)定上清液蛋白濃度，隨后按照SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別使用酶標(biāo)儀和可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式計(jì)算其含量。

1.2.7 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組大鼠在出生后第30天(P30)開(kāi)始進(jìn)行水迷宮測(cè)試。采用Morris水迷宮系統(tǒng)(SLY-WMS 2.0)，水池直徑1.8m。大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)與平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間及路徑由電腦系統(tǒng)自動(dòng)跟蹤記錄。第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練，平臺(tái)位于第三象限并高于水面1cm，將各組大鼠依序隨機(jī)于不同象限放入水迷宮，記錄尋找平臺(tái)時(shí)間及路徑，如大鼠未在60s內(nèi)找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其進(jìn)入平臺(tái)并停留學(xué)習(xí)10s；第2～5天則將平臺(tái)置于水面以下2cm，水中倒入墨汁混淆大鼠視野，將各組大鼠依序按照1、3、2、4象限和4、2、3、1象限交替放入水迷宮，記錄其尋找平臺(tái)的時(shí)間，如未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其進(jìn)入平臺(tái)學(xué)習(xí)10s；第6天時(shí)撤去平臺(tái)，從平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限(第一象限)將各組大鼠依序放入水迷宮，記錄各組大鼠在60s內(nèi)進(jìn)入原平臺(tái)象限的次數(shù)及停留時(shí)間。整個(gè)水迷宮過(guò)程中維持水溫在20～22℃，每天水迷宮結(jié)束后將每只大鼠擦干放回籠位飼養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布的情況下以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。水迷宮數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，圖片采用Image J 1.50i軟件進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理形態(tài)學(xué)改變 HE染色可見(jiàn)對(duì)照組與RES組海馬組織CA3區(qū)細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞周?chē)g隙正常，無(wú)水腫，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)；SEVO組神經(jīng)細(xì)胞腫脹，部分胞質(zhì)溶解，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、碎裂；SEVO+RES組雖也可見(jiàn)細(xì)胞周?chē)g隙增寬和固縮碎裂的細(xì)胞核，但其損傷程度較SEVO+RES組明顯減輕(圖1)。

2.2 海馬組織中caspase 3、SIRT1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，SEVO組caspase 3蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.05)；而相較于SEVO組，SEVO+RES組caspase 3表達(dá)則顯著減少(P＜0.05)，與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖2A)。與對(duì)照組相比，SEVO組SIRT1蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)；而與SEVO組相比，SEVO+RES組SIRT1蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖2B)。

圖1 各組海馬組織CA3區(qū)病理形態(tài)學(xué)觀察(HE ×200，n=4)Fig.1 Pathomorphological observations of CA3 region of the hippocampal tissues in each group (HE ×200，n=4)

2.3 SIRT1、PGC-1α與FOXO3α mRNA表達(dá) 與對(duì)照組比較，SEVO組海馬組織SIRT1、PGC-1α與FOXO3α mRNA水平均有不同程度下降(P＜0.05)；白藜蘆醇預(yù)處理后，SEVO+RES組三者的表達(dá)則明顯高于SEVO組(P＜0.05)，略低于對(duì)照組(圖3)。

2.4 海馬組織中SOD、MDA含量檢測(cè) 與對(duì)照組比較，SEVO組海馬組織中SOD含量明顯降低(P＜0.05)，MDA含量降低(P＜0.05)；而與SEVO組比較，SEVO+RES組海馬組織中SOD含量和MDA含量則明顯升高(P＜0.05)；SEVO+RES組海馬組織中SOD含量和MDA含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖4)。

2.5 Morris水迷宮測(cè)試學(xué)習(xí)記憶功能 從水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，各組平臺(tái)潛伏期時(shí)間均逐漸縮短。但是，無(wú)論是否給予RES預(yù)處理，七氟烷暴露后SEVO組及SEVO+RES組在平臺(tái)潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間以及穿越平臺(tái)次數(shù)上均與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05，圖5、6)。

圖2 各組海馬組織caspase 3蛋白(A)和SIRT1蛋白(B)表達(dá)變化的影響(n=6)Fig.2 Expressions of caspase 3 protein (A) and SIRT1 protein (B) of hippocampus in each group (n=6)

圖3 各組海馬組織SIRT1(A)、PGC-1α(B)與FOXO3α(C) mRNA表達(dá)的影響(n=6)Fig.3 Expressions of SIRT1(A), PGC-1α (B) and FOXO3α (C) mRNA of hippocampus in each group (n=6)

3 討 論

嬰幼兒腦發(fā)育時(shí)期是一個(gè)十分敏感的時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期，任何不利的外部因素都可能影響腦正常發(fā)育[8]。七氟烷作為兒科麻醉中最常用的吸入麻醉藥，其對(duì)發(fā)育期大腦的影響近年來(lái)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒時(shí)期接受全身麻醉者長(zhǎng)大后存在發(fā)生學(xué)習(xí)記憶障礙的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，七氟烷暴露會(huì)引起新生動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞凋亡和行為學(xué)異常，并且海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與學(xué)習(xí)記憶功能障礙密切相關(guān)[11-13]。本研究檢測(cè)了新生大鼠海馬區(qū)caspase 3蛋白的表達(dá)，新生大鼠暴露于2.5% SEVO 2h，連續(xù)3d會(huì)引起海馬區(qū)caspase 3的大量激活，引發(fā)更多神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。然而在七氟烷暴露前30min給予RES預(yù)處理可以明顯降低caspase 3的活性，減少細(xì)胞的損傷。這與RES在七氟烷暴露引起老年大鼠認(rèn)知損傷中下調(diào)caspase 3表達(dá)產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用是一致的[14]。因此，本研究認(rèn)為RES可以減輕七氟烷暴露引起的新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

圖4 各組海馬組織中SOD(A)、MDA(B)含量(n=4)Fig.4 Contents of SOD (A) and MDA (B) of hippocampus in each group (n=4)

圖5 各組大鼠逃避潛伏期的比較(n=10)Fig.5 Comparison of escape latency of rats in different groups (n=10)

圖6 各組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間(A)和穿越平臺(tái)次數(shù)(B)的比較(n=10)Fig.6 Comparison of the target quadrant residence (A) and the number of times of crossing platforms (B) in different group (n=10)

大腦是人體代謝最旺盛的器官之一，其耗氧量高，含有較多的不飽和脂肪酸，容易受到氧化應(yīng)激的影響，發(fā)育期的大腦則對(duì)氧化應(yīng)激尤為敏感。有研究指出，C57BL/6小鼠暴露于1.3%七氟烷中6h引起神經(jīng)元的損傷的機(jī)制與線粒體功能障礙導(dǎo)致的氧化應(yīng)激有關(guān)[15]。線粒體受到七氟烷的刺激，產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基(ROS)，ROS可以氧化細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)聚積，從而使線粒體腫脹，激活凋亡因子，引起細(xì)胞凋亡[16]。Boscolo等[17]的研究指出，使用ROS抑制劑可降低七氟烷暴露引起的ROS積聚，減輕對(duì)線粒體的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，RES預(yù)處理后，SEVO+RES組SOD活性明顯增強(qiáng)，MDA含量明顯下降，說(shuō)明RES可能通過(guò)其抗氧化作用減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減少七氟烷暴露引起的發(fā)育期神經(jīng)元損傷。

SIRT1是一種NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物組織。已有研究表明，SIRT1在調(diào)節(jié)糖脂代謝、延緩細(xì)胞衰老以及抵抗氧化應(yīng)激方面有積極作用[16]。近年來(lái)有大量研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1高表達(dá)也具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。PGC-1α與FOXO3α均是SIRT1下游底物，兩者均與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。其中PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)線粒體生物合成關(guān)鍵蛋白質(zhì)如線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)、細(xì)胞核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，Nrf1)和Nrf2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[18]，對(duì)線粒體的能量代謝與生物合成具有重要作用[19]，當(dāng)線粒體生物合成受到RNA干擾時(shí)可介導(dǎo)PGC-1α水平降低，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元回路發(fā)育突觸的形成明顯減少[20]。研究指出在多發(fā)性硬化癥小鼠模型中，PGC-1α表達(dá)上調(diào)可以增強(qiáng)線粒體功能，減少氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[21]；核轉(zhuǎn)錄因子FOXO3α屬于叉頭框蛋白家族，其廣泛地參與了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激損傷等多種生物調(diào)控過(guò)程[22-23]，是氧化應(yīng)激的重要感受器。它可以通過(guò)清除ROS降低細(xì)胞活性氧水平，同時(shí)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，防止腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡[24]。SIRT1可以對(duì)這兩者進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)去乙酰化，提高PGC-1α與FOXO3α活性，調(diào)控線粒體的生物合成，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力，減輕細(xì)胞凋亡。本研究使用SIRT1激動(dòng)劑RES有效地增強(qiáng)了SIRT1蛋白及其下游底物PGC-1α與FOXO3α基因的表達(dá)，說(shuō)明RES可能通過(guò)提高SIRT1及其下游基因PGC-1α與FOXO3α的表達(dá)，協(xié)同促進(jìn)腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平降低，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

Morris水迷宮是研究動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，常用于神經(jīng)科學(xué)的研究中。為了測(cè)試新生大鼠七氟烷反復(fù)暴露后對(duì)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能的影響，在出生后30d開(kāi)始，我們進(jìn)行了Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。有研究指出，單次或多次七氟烷暴露均會(huì)使大鼠產(chǎn)生不同程度的學(xué)習(xí)記憶障礙[2,20]，但是也有其他研究結(jié)果表明，單次七氟烷暴露對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶和行為沒(méi)有影響[3,21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是否進(jìn)行干預(yù)，七氟烷暴露后各組大鼠在逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)上均無(wú)明顯差異。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)七氟烷多次暴露可引起新生大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。RES預(yù)處理可通過(guò)上調(diào)SIRT1及其下游基因PGC-1α與FOXO3α的表達(dá)，降低七氟烷暴露后的氧化應(yīng)激水平，減輕腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但是，新生大鼠七氟烷暴露后并沒(méi)有引起成長(zhǎng)后的學(xué)習(xí)記憶損害，需要結(jié)合臨床進(jìn)一步長(zhǎng)期觀察進(jìn)行確認(rèn)。