韓旭，于潛，田野，趙希彤，張磊，周鏑，田大力

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胸外科，沈陽(yáng) 110032）

ABCE1基因全稱為ATP結(jié)合盒E1 （ATP-binding cassette E1） ，又稱為RNase L抑制因子［1-2］。近年來(lái)報(bào)導(dǎo)ABCE1主要參與真核生物蛋白翻譯和核糖體回收，HIV-1病毒殼組裝［3-6］。ABCE1還與肺癌密切相關(guān)，即ABCE1基因是一個(gè)參與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因［7-12］。在前期工作中應(yīng)用GST pulldown方法篩選出ABCE1蛋白的相互作用蛋白β-肌動(dòng)蛋白，并且應(yīng)用免疫共沉淀和免疫熒光染色初步證實(shí)了ABCE1和β-肌動(dòng)蛋白的相互作用。ABCE1基因的編碼蛋白能夠通過(guò)與細(xì)胞骨架蛋白的相互作用增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力［13］。本研究在此基礎(chǔ)上初步探討ABCE1基因的編碼蛋白和細(xì)胞骨架蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)域。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞與試劑

pGEX-4T-1-ABCE1及pGEX-4T-1-ABCE1-55構(gòu)建參考文獻(xiàn)［14］，A549肺腺癌細(xì)胞株 （中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存） 、E.coli Competent cells BL21 （DE3）pLysS （中國(guó) Tiangen 公司） 。GST pull-down 試劑盒 （美國(guó) Pierce 公司） 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG；中國(guó) Tiangen 公司） 、Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖珠 （美國(guó)GE公司） 、GST抗兔多克隆抗體 （美國(guó)Santa Crus公司） 、蛋白裂解液ProFoundTMLysis Buffer （美國(guó)Thermo公司） 、考馬斯亮藍(lán)染液R350 （美國(guó)GE公司） 、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker ［藍(lán)色，（117，85，49，34，25，19） ×103；中國(guó)Tiangen公司］。彩虹蛋白預(yù)染Marker ［ （170，130，95，72，55，43，34，26，17，10） ×103；美 國(guó)Fermentas公 司 ］。GST pull-down試劑盒 （美國(guó)Pierce公司） 。洗滌液：0.625% ProFoundTMLysis Buffer （美國(guó)Thermo公司） 、10 mmol/L三 （羥甲基） 氨基甲烷醋酸鹽，50 mmol/L 醋酸鉀，100 mmol/L NaCl，調(diào)pH至8.5。洗脫液：10 mmol/L 三 （羥甲基） 氨基甲烷醋酸鹽，50 mmol/L醋酸鉀，100 mmol/L NaCl，40 mmol/L 谷胱甘肽，調(diào)pH至7.4。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)及純化：將測(cè)序后重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-ABCE1-55轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布于LB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落若干，制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后鑒定陽(yáng)性克隆。挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落接種到含氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，培養(yǎng)基按1∶50將菌液稀釋，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6 時(shí)，加入終濃度0.4 mmol/L 的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜，取5 mL菌液，5 000 g離心5 min收集菌體，加入500 μL裂解液，5μL蛋白酶抑制劑混合物，超聲裂解，14 000 g離心10 min，取上清，加125 μL 5×SDS電泳緩沖液，100 ℃加熱5 min，冰上放置，取10 μL進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察電泳結(jié)果。400 μL蛋白上清與Glutathione Sepharose 4B瓊脂糖珠混合，旋轉(zhuǎn)器10圈/min，4 ℃旋轉(zhuǎn)混合3 h，3 00 μL 洗滌液洗3次，1 000 r/min離心；50 μL 洗脫液孵育10 min，1 000 r/min離心。

1.2.2 GST pull-down實(shí) 驗(yàn) 方 法［13］。按 照Pierce公司的GST pull-down試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以GSTABCE1-55 和GST-ABCE1重組蛋白分別與Glutathione- Sepharose 4B結(jié) 合 固化，再 與LTEP-a-2細(xì)胞株蛋白裂解液孵育，3 00 μL 洗滌液洗3次，1 000 r/min離心；50 μL 洗脫液孵育10 min，1 000 r/min離心。取10 μL進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pGEX-4T-1-ABCE1-55測(cè)序結(jié)果

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，第55號(hào)質(zhì)粒插入ABCE1基因1 072位的“G”突變?yōu)椤癟” （ 圖1） ，形成終止密碼子“TGA”，缺失從第358到第600位氨基酸 （圖2） 。該質(zhì)粒會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)出帶有GST標(biāo)簽的含有357個(gè)氨基酸的重組蛋白，命名為GST-ABCE1-55，預(yù)計(jì)蛋白質(zhì)大小為66×103。

圖1 第55號(hào)質(zhì)粒插入ABCE1基因測(cè)序結(jié)果Fig.1 Gene sequencing results of pGEX-4T-1-ABCE1-55

圖2 第55號(hào)質(zhì)粒插入的基因編碼氨基酸ABCE1_aa：ABCE1氨基酸序列；55_aa：pGEX-4T-1-ABCE1-55氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of pGEX-4T-1-ABCE1-55

2.2 GST-ABCE1-55和GST-ABCE1蛋白表達(dá)

pGEX-4T-1-ABCE1-55和pGEX-4T-1-ABCE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21宿主菌后，與未誘導(dǎo)菌液比較，在預(yù)計(jì)位置得到新增條帶 （圖3） 。進(jìn)一步用抗GST抗體檢測(cè)誘導(dǎo)的表達(dá)蛋白，在預(yù)計(jì)位置分別誘導(dǎo)菌液中檢測(cè)到GST-ABCE1-55和 GST- ABCE1表達(dá) （圖4） 。

2.3 GST pull-down方法驗(yàn)證GST-ABCE1-55、GST-ABCE1蛋白與β-肌動(dòng)蛋白的相互作用 （圖5）

分別以GST-ABCE1-55和GST-ABCE1重組蛋白為誘餌蛋白，應(yīng)用GST pull-down技術(shù)在肺腺癌LTEP-a-2細(xì)胞株蛋白裂解液上清中驗(yàn)證相互作用蛋白，2組經(jīng)SDS-PAGE電泳并考馬斯亮藍(lán)染色后，于GSTABCE1組43×103和55×103之間可見(jiàn)特異條帶標(biāo)記為β-actin，而GST-ABCE1-55組未見(jiàn)特異條帶。

圖3 GST-ABCE1-55 、GST-ABCE1重組蛋白的表達(dá)Fig.3 Protein expression of GST-ABCE1-55 and GST-ABCE1

圖4 Western blotting驗(yàn)證重組蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of GST-ABCE1-55 and GST-ABCE1 protein analyzed by Western blotting

圖5 GST pull-down驗(yàn)證GST-ABCE1-55，GST-ABCE1蛋白與β-肌動(dòng)蛋白的相互作用Fig.5 Interaction between GST-ABCE1-55 and β-actin，GSTABCE1，and β-actin in GST pull-down assay

3 討論

ABCE1基因位于人類4號(hào)染色體4q31上，由1 800個(gè)堿基組成，編碼1個(gè)含600氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量68×103。除了作為RNase L抑制因子、真核生物蛋白翻譯和核糖體回收、HIV-1病毒殼組裝之外，ABCE1在多種惡性腫瘤中有較高表達(dá)［15-23］。

在本課題組的前期研究中，ABCE1基因能夠促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用。通過(guò)應(yīng)用GST pull-down結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，以GST-ABCE1融合蛋白為誘餌，篩選出ABCE1的相互作用蛋白（β-肌動(dòng)蛋白）。然后應(yīng)用免疫共沉淀及共定位分析驗(yàn)證了β-肌動(dòng)蛋白與ABCE1的相互作用關(guān)系，上調(diào)ABCE1蛋白使細(xì)胞骨架微絲的結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，進(jìn)而增強(qiáng)了肺腺癌LTEP-a-2細(xì)胞的遷移、侵襲能力［13］。

β-肌動(dòng)蛋白是微絲的主要成分，是一種中等大小的蛋白質(zhì)。單體β-肌動(dòng)蛋白有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：1個(gè)是ATP結(jié)合位點(diǎn)，另外2個(gè)都是與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)。肌動(dòng)蛋白有2種基本形式，球形肌動(dòng)蛋白單體 （G-actin） 和聚合肌動(dòng)蛋白微絲 （F-actin） 。大量研究［24-25］證實(shí)，真核細(xì)胞遷移是由肌動(dòng)蛋白單體聚合成微絲驅(qū)動(dòng)的。隨著微絲成熟，結(jié)合在肌動(dòng)蛋白中央裂隙處的ATP 水解，水解與磷酸的釋放不是同步進(jìn)行的，其中ATP水解速率是磷酸釋放的10倍，因此ADP-Pi-F-肌動(dòng)蛋白是微絲中間的主要形式。磷酸釋放后形成ADP-F-肌動(dòng)蛋白，然后單體從頭端解離。解離的ADP-肌動(dòng)蛋白單體可以進(jìn)行核苷酸交換，再形成ATP-肌動(dòng)蛋白單體。可以用于新一輪的聚合。這種由ATP水解驅(qū)動(dòng)的、有方向的微絲生長(zhǎng)稱為“踏車運(yùn)動(dòng)”，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移。

根據(jù)KARCHER等［26］研究的ABCE1三維衍射模型，ABCE1蛋白有2個(gè)核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 （nucleotide binding domain，NBD） ，只編碼表達(dá)至第357位色氨酸的GST-ABCE1-55蛋白缺失了NBD1結(jié)構(gòu)域和一些富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。在本研究中，分別以GSTABCE1-55和GST-ABCE1重組蛋白為誘餌蛋白，應(yīng)用GST pull-down技術(shù)在肺腺癌LTEP-a-2細(xì)胞株蛋白裂解液上清中驗(yàn)證相互作用蛋白，結(jié)果顯示，GSTABCE1-55并沒(méi)有結(jié)合β-肌動(dòng)蛋白，但是重組表達(dá)的GST-ABCE1-55能夠結(jié)合β-肌動(dòng)蛋白，說(shuō)明GSTABCE1-55缺失的第358位至600位氨基酸序列包含能與β-肌動(dòng)蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。影響ABCE1蛋白結(jié)構(gòu)的完整性和立體構(gòu)象，從而影響與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合。

蛋白質(zhì)之間無(wú)時(shí)無(wú)刻都在進(jìn)行著相互作用，從而決定一個(gè)細(xì)胞甚至一個(gè)生物體的命運(yùn)。研究蛋白質(zhì)相互作用是如何發(fā)生的，對(duì)于了解生物過(guò)程的分子機(jī)制，闡明疾病的分子基礎(chǔ)，確定潛在的治療靶點(diǎn)都是至關(guān)重要的。本研究首次證實(shí)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因ABCE1表達(dá)蛋白與β-肌動(dòng)蛋白的相互作用結(jié)構(gòu)域應(yīng)該位于第358位至600位的氨基酸編碼區(qū)，為進(jìn)一步精確研究ABCE1與細(xì)胞骨架蛋白之間的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。