李 敏,周明偉,劉翔宇,孫銘徽,賈玉璽*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 皮膚科，吉林 長春130033；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性皮膚病，發(fā)病率約為4%，致病因素可能與下列因素有關(guān)：黑素細(xì)胞自毀、氧化應(yīng)激、自由基、免疫發(fā)病學(xué)說、細(xì)胞因子、微量元素等。研究表明，8-MOP對(duì)B16細(xì)胞有一定的增殖作用[1]，糖皮質(zhì)激素是治療白癜風(fēng)的有效藥物之一，酪氨酸酶是黑素合成限速酶，其活性與黑素合成呈正相關(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠B16黑素瘤細(xì)胞為模型，通過酶學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選復(fù)方倍他米松注射液對(duì)小鼠B16細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素生成的影響，探討其治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

小鼠B16黑素瘤細(xì)胞株(中國科學(xué)院軍事研究所提供)。胎牛血清及RPMI1640(Gibco)；二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚、L-多巴為Sigma公司產(chǎn)品；CCK-8試劑(東洋紡織)。復(fù)方倍他米松注射液(國藥準(zhǔn)字J20140160,進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)、批號(hào)H201301888、 6BBKADAC03)。甲氧沙林(8-MOP)，重慶華邦制藥股份有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字H50021757)。倒置生物顯微鏡(LaiKa公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Epoch BioTek)、二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋)。

1.2方法

1.2.1小鼠B16黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)[3]1640培養(yǎng)基傳代，置于含5%CO2飽和濕度，溫度為37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，用胰蛋白酶(體積分?jǐn)?shù)0.25%)消化生長至融合狀態(tài)的細(xì)胞，每3天傳代1次，每瓶約105個(gè)細(xì)胞傳代至25 cm2。

1.2.2細(xì)胞增殖活性測定 取100 μl消化好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞液(5×104個(gè)/ML)，接種于96孔板，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)24 h，設(shè)定復(fù)方倍他米松低、中、高劑量組(培養(yǎng)基+復(fù)方陪他米松),最終工作濃度為10、20、40 μmol/L；甲氧沙林低、中、高劑量組(培養(yǎng)基+甲氧沙林)，甲氧沙林最終工作濃度分別為10、50、100 μmol/L；細(xì)胞陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基)。向培養(yǎng)板每孔加入 10 μl不同濃度的待測物質(zhì)，孵育48 h，向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，孵育2 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置酶標(biāo)儀450 nm波長測吸光度值，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取均值。

1.2.3黑素含量測定(氫氧化鈉裂解法) 細(xì)胞接種方法同上，預(yù)先用不同濃度復(fù)方倍他米松注射液、甲氧沙林培養(yǎng)細(xì)胞72 h后棄上清液，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入氫氧化鈉(100 μmol·L-1)，37℃水浴1 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值，用所測的吸光度值表示黑素生成量,實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取均值。

1.2.4酪氨酸酶活性的測定[4]細(xì)胞接種方法同上，不同藥物作用72 h后棄上清液，磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗2次，每孔加入100 μl體積分?jǐn)?shù)1%聚乙二醇辛基苯基醚，震蕩5 min ，置于-20℃1 h ，隨室溫融化，細(xì)胞完全裂解，每孔加入100 μl磷酸鹽緩沖液配制體積分?jǐn)?shù)為0.1% L-多巴液，37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度值，用所測吸光度值表示酪氨酸酶的活性，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖活性測定

與對(duì)照組相比，各濃度復(fù)方倍他米松注射液及中、高濃度甲氧沙林在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各濃度復(fù)方倍他米松注射液與甲氧沙林相比，促進(jìn)細(xì)胞增殖方面作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，復(fù)方倍他米松注在高濃度有顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方倍他米松注射液對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖活性的影響

注：與對(duì)照組比較aP<0.05,與甲氧沙林組比較bP<0.05

2.2黑素生成含量測定

與對(duì)照組相比，各濃度復(fù)方倍他米松注射液及甲氧沙林在促進(jìn)細(xì)胞黑素生成作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各濃度復(fù)方倍他米松注射液與甲氧沙林促進(jìn)細(xì)胞黑素生成作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著復(fù)方倍他米松注射液濃度的增大黑素合成逐漸增加，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方倍他米松注射液對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑素生成量的影響

注：與對(duì)照組比較aP<0.05,與甲氧沙林組比較bP<0.05

2.3酪氨酸酶活性測定

與對(duì)照組相比，各濃度復(fù)方倍他米松注射液及甲氧沙林在促進(jìn)酪氨酸酶活性作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中、高濃度復(fù)方倍他米松注射液與甲氧沙林相比，在促進(jìn)酪氨酸酶活性作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著復(fù)方倍他米松注射液濃度的增大酪氨酸酶活性逐漸增加，結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方倍他米松注射液對(duì)小鼠B16 黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

注：與對(duì)照組比較aP<0.05,與甲氧沙林組比較bP<0.05

3 討論

白癜風(fēng)易診斷難治療，目前治療方案主要分為外用藥物治療，如糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑；光療法，如NB-UVB，308準(zhǔn)分子激光；手術(shù)治療，如皮膚碎片移植、負(fù)壓吸皰表皮移植及聯(lián)合治療，但尚無可維持長期療效的治療方案[5]。

本實(shí)驗(yàn)探討了復(fù)方倍他米松注射液對(duì)酪氨酸酶、黑素瘤細(xì)胞增殖、黑素生成的影響，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵限速酶[6]。目前，酪氨酸酶的活性成為研究白癜風(fēng)等色素障礙性疾病的靶點(diǎn)。結(jié)果顯示：對(duì)照組比較，不同濃度組復(fù)方倍他米松注射液可對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性均有明顯的促進(jìn)作用，其中高濃度效果明顯，且各指標(biāo)具有一致性。酪氨酸酶活性增加，可促進(jìn)黑素合成，從而可能提高白癜風(fēng)的治療效果[2]。糖皮質(zhì)激素治療白癜風(fēng)機(jī)制可能是一個(gè)雙向的過程：首先，糖皮質(zhì)激素可抑制免疫系統(tǒng)異常導(dǎo)致的黑素細(xì)胞損傷，從而刺激黑素細(xì)胞再生，同時(shí)可以刺激黑素細(xì)胞的生物合成進(jìn)而刺激黑素細(xì)胞再生[7]。本試驗(yàn)為復(fù)方倍他米松注射液治療色素脫失性疾病奠定了理論依據(jù)。