李 源,張為遠(yuǎn),阮 焱*,舒 暢

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，北京100026;中國科學(xué)院基因組科學(xué)與信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

自然流產(chǎn)是指妊娠不滿 28 周、胎兒體重不足1 000 g，妊娠自行終止者。妊娠 12 周之內(nèi)終止的稱為早期流產(chǎn)。自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%-40%，而其中 80%以上為發(fā)生在 12 周之內(nèi)的早期流產(chǎn)[1]。但是，至今為止，導(dǎo)致早期流產(chǎn)的非細(xì)胞遺傳因素及其相關(guān)機(jī)制仍不完全清楚。有研究認(rèn)為，早期妊娠終止與滋養(yǎng)層細(xì)胞生長不良及其侵襲性受損相關(guān)[2]。因此，早期妊娠終止可能與晚期妊娠并發(fā)癥如子癇前期和胎兒生長受限的胎盤缺陷機(jī)制相似[3]。此外，還有研究證實(shí)，子癇前期胎盤缺陷早于妊娠11周[4,5]。

微小RNA (microRNA，miRNA) 是進(jìn)化上高度保守的長約22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA，通過靶向特異性信使RNA (mRNA) 調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)[6]。它們在細(xì)胞生物學(xué)的許多方面起著至關(guān)重要的作用，包括參與代謝，凋亡和分化等等。近年來，有關(guān)microRNA的研究不斷深入且獲得了巨大而廣泛的發(fā)展。研究以確定內(nèi)源性microRNA的靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。最近，已經(jīng)有研究探討不同病理狀態(tài)胎盤中的miRNA的表達(dá)模式。然而，這些研究主要側(cè)重于特定的胎盤miRNA，如19號染色體miRNA簇(C19MC)和14號染色體miRNA簇(C14MC)[7,8]。

由于人類滋養(yǎng)層細(xì)胞在前3個(gè)月與腫瘤細(xì)胞在體外具有相似的固有的侵襲特性[9]，因此我們推測，已報(bào)道的在腫瘤浸潤過程必不可少的某些miRNA在滋養(yǎng)層細(xì)胞植入和胎盤分化過程中也可能具有未被發(fā)現(xiàn)的功能。 miRNA-17-92簇是人類癌癥中表達(dá)最廣泛的一種，其中包括B細(xì)胞淋巴瘤[10]，肺癌[11]和結(jié)腸癌[12]。事實(shí)上，miRNA-17-92可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和遷移[13]。該簇是位于染色體13q31上的多順反子miRNA基因。它包含6種不同的miRNA， 即-17、-18a、-19a、-20a、-19b和-92；但其中一些具有相同的種子序列[13]。 MiRNA-17和-19被認(rèn)為是該簇內(nèi)的主要成分，據(jù)報(bào)道，它們對腫瘤細(xì)胞的入侵和遷移起著至關(guān)重要的作用[14]。

在miRNA-17和-19b的許多預(yù)測基因靶點(diǎn)中，PTEN(在10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物)是最常被報(bào)道的[15]。 PTEN是常見的腫瘤抑制基因，在人類癌癥和轉(zhuǎn)移腫瘤中其表達(dá)水平通常下調(diào)[16]。 PTEN通過拮抗磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)在廣泛的細(xì)胞過程(包括細(xì)胞生長，增殖和細(xì)胞遷移)中起多重作用[16]。 miRNA-17的其他不同靶標(biāo)包括CREB-1(CAMP反應(yīng)性元件結(jié)合蛋白1)和TGF-β RII (轉(zhuǎn)化生長因子，β受體II)[17]。此外，已經(jīng)表明miRNA-17可通過抑制TGF β1信號通路促進(jìn)血管生成和腫瘤生長[18]。

因此，本課題旨在確定miRNA-17-92簇的主要成員(即miRNA-17)是否在妊娠早期的胎盤中表達(dá)，同時(shí)明確其在懷孕早期流產(chǎn)孕婦胎盤絨毛組織中的表達(dá)水平。

1 材料和方法

1.1研究對象

本研究的全部參加者均在2014年1月1日至2016年12月31日期間就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院計(jì)劃生育門診，研究對象均為懷孕早期(7-9周)的孕婦。本項(xiàng)目經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，每位患者均知情同意參加本課題研究，并于研究開始之前簽署書面知情同意書。由于非醫(yī)療原因要求終止妊娠的30孕婦作為對照組，由于早期妊娠終止而接受清宮手術(shù)的28例孕婦作為實(shí)驗(yàn)組。參與本研究的孕婦中均無免疫性疾病、慢性病及吸煙史。

1.2絨毛組織

在人工流產(chǎn)手術(shù)后立即獲得絨毛組織樣品，置于RNAlater溶液(RNA穩(wěn)定劑，Qiagen，Hiden，Germany)中以保持穩(wěn)定避免RNA降解。然后，在4℃下儲(chǔ)存直至第二天，使用高分辨率立體顯微鏡去除蛻膜和殘余血管，隨之將樣品在-80℃下保存直至進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

1.3RNA和microRNA分離提取

根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，使用QIAzol1 Lysis Reagent (Qiagen)和miRNeasy Mini Kit (Qiagen)，從5mg絨毛組織中提取總RNA，包括microRNA。在14 ml無RNase的水中，從旋轉(zhuǎn)柱膜上洗脫RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies /Thermo Scientific)通過260和280 nm處的吸光度測量來評估RNA純度。所有樣品的A260 / A280比值大于1.90，證實(shí)了純度高。

1.4反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)

此后，根據(jù)生產(chǎn)廠商說明書，使用miScript II RT試劑盒(Qiagen)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總反應(yīng)體積為20 μl。在總反應(yīng)混合物中使用2 μl cDNA進(jìn)行靶基因的PCR測定。運(yùn)用7900HT實(shí)時(shí)快速PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行檢測。 miScript SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen)用于測定miRNA 17-92：miRNA-17(引物Hs_miR_17_2，目錄號MS00029274)。使用snRNA U6(引物Hs_RNU6B_2_1，目錄號MS00029274)作為內(nèi)參對照。使用25ul總反應(yīng)體積中的2 μl cDNA進(jìn)行miRNA的PCR測定。

1.5數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析

使用REST(relative expression software tool，相對表達(dá)式軟件工具)分析數(shù)據(jù)，其中使用的數(shù)學(xué)模型基于樣本和對照組之間的平均閾值周期(CT)差異。該軟件通過隨機(jī)測試與成對重新分配來評估對照和病例樣本之間的表達(dá)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這種統(tǒng)計(jì)方法的優(yōu)點(diǎn)是沒有采用正態(tài)性假設(shè)，而且與傳統(tǒng)參數(shù)測試一樣強(qiáng)大[19]。Fisher精確檢驗(yàn)用于比較分類變量。采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)用于數(shù)據(jù)分析。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者的主要臨床特征之間未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。來自早期妊娠流產(chǎn)的絨毛組織中miRNA-17的表達(dá)水平較對照組下降了兩倍以上(相對表達(dá)分別為0.35)(圖1)。由于我們發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)水平與胎齡無相關(guān)性，因此無需對胎齡進(jìn)行任何調(diào)整。

表1 研究對象的臨床特征

注：數(shù)據(jù)以n(%)、平均值或四分位范圍(IQR，interquartile range)的形式表示。統(tǒng)計(jì)方法使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。

圖1 絨毛組織中miRNA-17表達(dá)水平的組間差異

來自早期妊娠流產(chǎn)(1.505±0.580)的絨毛組織中miRNA-17的表達(dá)水平較對照組(4.349±0.104)下降了兩倍以上(相對表達(dá)為0.35；P<0.001)。

3 討論

本課題研究了早期懷孕期間miRNA-17在胎盤的表達(dá)水平，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：miRNA-17在自發(fā)流產(chǎn)病例的絨毛組織中的表達(dá)水平呈顯著下降。本研究表明，miRNA-17可能參與早期人類胎盤形成。

由于人類胎盤在妊娠前期是一種具有高度侵襲性和增殖性的結(jié)構(gòu)，所以一般認(rèn)為自發(fā)流產(chǎn)是早期胎盤缺陷所致。 而且，這與其他妊娠并發(fā)癥的病理生理機(jī)制具有共同的特點(diǎn)，如自發(fā)早產(chǎn)，先兆子癇和胎兒生長限制[3,20]。

成長過程中的胎盤和腫瘤都具有早期侵襲能力，這樣才能允許他們建立最佳的血液和營養(yǎng)供應(yīng)來保持持續(xù)增長的狀態(tài)和能力[21]。因此，它們之間可能具有類似的機(jī)制，從而可以在人類組織的侵襲和擴(kuò)散中獲得成功。本研究證實(shí)，與正常妊娠相比早期自然流產(chǎn)中miRNA-17是人類癌癥中最常擴(kuò)增的microRNA之一，通常被稱為“oncomiR”，明顯下調(diào)。這反之表明這種miRNA可能在早期胎盤形成及其發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。

盡管廣泛的研究致力于了解miRNA-17-92簇在致癌基因中的作用，但是該簇在正常組織中的生理作用尚不清楚。在小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)提示，miRNA-17-92簇的缺陷表達(dá)與產(chǎn)后存活不相符[22]。此外，在實(shí)驗(yàn)研究中，miRNA-17-92的高表達(dá)已經(jīng)在多種組織的早期發(fā)育階段被報(bào)道[23]。這促使我們設(shè)計(jì)這項(xiàng)研究，以確定該群體的成員是否在人胎盤早期階段表達(dá)，并明確其在人類妊娠過程中所發(fā)揮的相關(guān)作用。

本課題屬于初步探索性質(zhì)，盡管樣本量較小，但是本研究仍然提供了對人類早期胎盤形成的一些關(guān)鍵相關(guān)機(jī)制的線索，提示miRNA-17對于人早期胎盤形成是至關(guān)重要的。本研究的一個(gè)可能的限制是沒有流產(chǎn)病例的具體相關(guān)原因的數(shù)據(jù)。但據(jù)既往研究報(bào)道認(rèn)為，無論是什么原因，流產(chǎn)的滋養(yǎng)層絨毛組織樣本都適合于早期胎盤研究，因?yàn)樗鼈兌继崾咀甜B(yǎng)層功能障礙[24]。

總之，我們提供了miRNA 17這一主要代表的胎盤表達(dá)數(shù)據(jù)，其屬于人類中最高度保守的miRNA簇之一，本研究數(shù)據(jù)明確提示其可能參與早期胎盤形成。進(jìn)一步研究探索這種miRNA簇在胎盤相關(guān)疾病如先兆子癇和胎兒生長受限中的作用，及其細(xì)胞生物學(xué)功能和調(diào)控的靶基因是非常必要的。