王立賽，閆明科，王 晗，沈仁芳，蘭 平*

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一個響應(yīng)土壤缺鐵擬南芥突變體的分離及鑒定①

王立賽1,2，閆明科1,2，王 晗1，沈仁芳1，蘭 平1*

(1土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；2中國科學院大學，北京 100049)

鐵是植物生長發(fā)育必需的一種微量元素，但土壤中植物可直接吸收利用的鐵非常有限。缺鐵使作物生長受限，進而影響人類膳食健康。植物體能通過調(diào)節(jié)一系列基因表達的變化來響應(yīng)缺鐵，但目前對該調(diào)控系統(tǒng)的研究仍不完善。()是擬南芥中一個強烈響應(yīng)缺鐵的基因，本研究將該基因啟動子連接熒光素酶報告基因并轉(zhuǎn)化擬南芥，進一步通過T-DNA的隨機插入得到一個響應(yīng)缺鐵信號的突變體庫。通過篩選該突變體庫，我們得到一個強烈響應(yīng)缺鐵信號的突變體L22-8。和野生型相比，正常情況下L22-8地上部和地下部內(nèi)源的表達量均顯著增高，缺鐵處理時其地上部表達量仍高于野生型，而地下部則不明顯。定量結(jié)果顯示，和等植物鐵代謝關(guān)鍵調(diào)控因子的表達發(fā)生了顯著變化，但植株總鐵、磷、鋅的含量較野生型并沒有顯著區(qū)別，表明該T-DNA的插入雖影響了植株對缺鐵脅迫的響應(yīng)，但并不直接作用于植株對鐵的吸收、轉(zhuǎn)運上。反向PCR分析發(fā)現(xiàn)L22-8的T-DNA插入位點位于和之間，且這兩個基因的轉(zhuǎn)錄表達在正常生長條件下均略低于Col-0。基因互補實驗發(fā)現(xiàn)僅有能部分互補L22-8的熒光信號，表明基因的表達影響了對缺鐵脅迫的響應(yīng)。本研究進一步擴展了植物吸收利用鐵的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子育種工作提供了指導。

土壤；缺鐵脅迫；突變體鑒定；分子調(diào)控

鐵是動植物生長必需的、需求量最大的微量營養(yǎng)元素[1]，在高等植物的光合作用和呼吸作用等多種生命活動中起非常重要的作用[2]，同時也是許多功能蛋白的重要輔助因子[3]。植物缺鐵會導致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的降低，危害人體的營養(yǎng)健康，如人體貧血的一個常見原因就是鐵元素的缺乏。雖然鐵在地殼中的含量豐富，但因為鐵元素大多以Fe3+的形式存在，在中性和堿性土壤中的溶解度極低，從而限制了土壤中鐵的有效性，使得植物生長易受缺鐵的限制[4-5]，隨著土壤鹽堿化程度加劇，植物缺鐵現(xiàn)象愈發(fā)普遍。因此，闡明植物體內(nèi)鐵平衡機制、通過育種工作提高植物體內(nèi)鐵含量有益于促進農(nóng)業(yè)發(fā)展和人體健康[6-7]。植物在長期的進化過程中，演化出一套完整的鐵吸收、轉(zhuǎn)運的分子調(diào)節(jié)系統(tǒng)。根據(jù)植物對鐵吸收機制的不同，分為兩大類：非禾本科植物所采用的機理Ⅰ，及禾本科植物所采用的機理Ⅱ[8]。其中機理Ⅰ又可分為3個組成部分，即H+-ATPase泵系統(tǒng)、Fe3+還原系統(tǒng)和Fe2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。一些H+-ATPase(HA)基因，如擬南芥中的基因的表達，能通過H+-ATPase作用將H+分泌到質(zhì)外體[9]。功能缺失突變體的分析發(fā)現(xiàn)是引起缺鐵誘導根際酸化的主要成員[10]。H+的分泌可以降低土壤pH，提高土壤中鐵等營養(yǎng)元素的溶解性[11]，通過根細胞質(zhì)膜上的鐵離子螯合還原酶(ferric-chelate reductase oxidase，F(xiàn)RO)和與之偶聯(lián)的NADPH脫氫酶，如擬南芥中的Fe3+螯合還原酶將Fe3+還原為Fe2+[12]，再通過一系列鐵轉(zhuǎn)運蛋白(iron-regulated transporter，IRT)，如擬南芥中的IRT1將還原的Fe2+轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)[13]，之后通過其他的一些轉(zhuǎn)運載體運送到植物各個細胞器或器官中供機體利用。采用機理Ⅱ的禾本科植物可在根部合成高鐵載體(Phytosiderophores，PS)如麥根酸類物質(zhì)(mugineic acid, MA)并分泌到土壤中，這類物質(zhì)對Fe3+具有很高的親和性，可以促進低鐵環(huán)境下根際鐵的活化。Fe3+-PS螯合物經(jīng)YS1(YELLOW STRIPE 1)和YSL(YELLOW STRIPE1-like)轉(zhuǎn)運載體吸收至胞內(nèi)，再釋放出Fe3+供代謝利用[14]。

近年來的轉(zhuǎn)錄組和分子遺傳學分析鑒定得到了一系列與植物鐵吸收利用相關(guān)的基因和蛋白，如非禾本科植物鐵吸收的重要調(diào)控基因和。首次在番茄中被鑒定出來，其編碼一個bHLH轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[15]；當環(huán)境中鐵濃度過低時表達增強，過高時則在轉(zhuǎn)錄后水平上受到抑制[16]。擬南芥中的(FER-like iron deficiency-induced transcription factor)是番茄基因的同源基因,主要在根部受缺鐵脅迫誘導表達，且只在缺鐵脅迫下，才能激發(fā)上下游基因的相互作用[7]。FIT可以與bHLH蛋白家族(AtbHLH38、AtbHLH39、AtbHLH100、AtbHLH101)形成異源二聚體，有效誘導和基因的表達，從而提高植物對缺鐵脅迫的耐受性[17-18]。有研究證實，bHLH轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ROREYE(PYE)在缺鐵條件下對根的生長起重要作用，PYE負調(diào)控植物體內(nèi)鐵平衡相關(guān)基因的表達[19]。bHLH34、bHLH104與bHLH105能夠形成同源二聚體或異源二聚體，激活和的轉(zhuǎn)錄表達，進而激活下游鐵吸收及轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達，bHLH104與bHLH105可與鐵吸收負調(diào)控因子E3泛素連接酶BTS相互作用，以此防止植物對鐵的過量吸收[6,20-21]。雖然前期研究已經(jīng)得到了FIT等眾多鐵代謝相關(guān)的調(diào)控基因和蛋白，但仍有很多響應(yīng)土壤鐵含量變化的基因功能未被闡明，特別是一些用來維持植物體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的負調(diào)控因子，仍需進一步探索[3,7,14]。

編碼細胞色素P450 (CYTOCHR-OMEP450)蛋白，能夠強烈響應(yīng)缺鐵脅迫。細胞色素P450基因家族成員、()、()均屬缺鐵脅迫上調(diào)基因，且擬南芥基因在缺鐵脅迫下響應(yīng)最為強烈，有研究表明基因通過其啟動子部位的IDE1-like序列(iron deficiency-responsive element)響應(yīng)鐵缺乏的早期反應(yīng)[22]。為尋找到更多早期響應(yīng)缺鐵脅迫的調(diào)控因子，本文以模式植物擬南芥為研究材料，首先分離出基因的啟動子，再連接報告基因，構(gòu)建成pCAMBIA2300-::基因表達載體，通過轉(zhuǎn)化擬南芥得到T-DNA隨機插入突變體庫，然后通過確定突變體的T-DNA插入位點，找到影響基因轉(zhuǎn)錄表達的上游基因。探索可能存在的調(diào)控基因表達的新的調(diào)控因子，并探討新調(diào)控因子的基因功能。旨在完善植物缺鐵響應(yīng)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為促進植物高效利用土壤中鐵元素打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與突變體庫的建立

供試材料為擬南芥(L.) Columia -0生態(tài)型(Col-0)。以擬南芥Col-0基因組DNA為模板，擴增目的基因啟動子(1149bp)，所用引物：F:5’- AAGGTTTTCT-CTGATTGGAAATTG-3’, R:5’-ACGCGATTGAA-GAGTAGTGTCTGTC-3’，兩條引物5’ 端分別帶有Ⅰ與Ⅰ酶切位點。如圖1，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接pCAMBIA2300-載體，構(gòu)成目的基因表達載體pCAMBIA2300-::。實驗中所用酶均為Thermo Scientific產(chǎn)品。

圖1 載體構(gòu)建

通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法得轉(zhuǎn)基因株系，抗性(卡那霉素，Kanamycin)篩選得到單拷貝純合株系，通過熒光觀察從中選取一到兩株符合缺鐵表達特性的穩(wěn)定表達株系作為母本，再次進行T-DNA插入突變，篩選過程中尋找特殊熒光變化的株系，構(gòu)建突變體庫。

1.2 材料處理與方法

1.2.1 種子處理及培養(yǎng)條件 擬南芥種子表面消毒：首先使用75% 酒精洗滌2 ~ 3 min；再經(jīng) Tween (0.5%,/)，NaClO (0.5%,/)的混合水溶液震蕩洗滌10 min，最后使用滅菌超純水洗5 ~ 6遍。播種前4 ℃春化1 ~ 2 d，根據(jù)不同實驗項目播種到正常或缺鐵培養(yǎng)基上，生長于恒溫培養(yǎng)箱中(22 ℃,60 μmol/(m2·s)，16 h光照，8 h黑暗)。正常及缺鐵處理培養(yǎng)基：ES培養(yǎng)基(5 mmol/L KNO3, 2 mmol/L Ca(NO3)2, 2 mmol/L MgSO4, 2.5 mmol/L KH2PO4, 70 μmol/L H3BO3, 14 μmol/L MnCl2, 0.2 μmol/L Na2MoO4, 1 μmol/L ZnSO4, 0.5 μmol/L CuSO4, 10 μmol/L NaCl, 40 μmol/L Fe-EDTA，10 g/L蔗糖，0.918 g/L MES，8 g/L瓊脂，用1 mmol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至5.5；缺鐵處理(即ES培養(yǎng)基中除不添加Fe-EDTA，添加100 μmol/L Ferrozine螯合培養(yǎng)基中的多余鐵元素，其他均一致)，121 °C高溫滅菌20 min。種子抗性篩選培養(yǎng)基用1/2MS(Duchefa Biochemie公司)+ Kanamycin (50 mg/L)。

1.2.2 熒光檢測及篩選 將在正常培養(yǎng)基上生長10 d的擬南芥幼苗分別轉(zhuǎn)移至正常和缺鐵培養(yǎng)基表面繼續(xù)培養(yǎng)3 d，均勻噴灑熒光底物D-Luciferin(1 mmol/L D-Luciferin+0.01% TritonX-100)處理3 min后，通過化學發(fā)光儀(Tanon-5200，中國)拍攝熒光信號。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄水平基因表達量檢測 將在正常培養(yǎng)基上生長10 d的擬南芥幼苗移至正常和缺鐵培養(yǎng)基上繼續(xù)生長3 d，地上部與地下部分開取材。用Trizol法提取樣品RNA，并使用Nanodrop2000及電泳檢測RNA濃度及質(zhì)量。采用PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa) 將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，用于基因轉(zhuǎn)錄表達的半定量及定量檢測。用TaqMix酶(康維)進行半定量的PCR擴增檢測，用實時定量PCR儀(Thermo PIKOREAL96)對基因表達進行定量檢測，內(nèi)參基因選用()，基因相對表達量用2-△△Ct公式計算。半定量、定量檢測所需引物：-RT-S: 5’-CCAGCTAACGACATCTACAACG-3’，-RT-A: 5’-GTAGTCGGTCTTGCTATCCATG-3’；-F: 5’- GTGCTGAAGGTGGAGACGAT-3’，-R: 5’- AACACGAAGACCGAACGAAT-3’。同時將，，，作為缺鐵處理的標記基因。

1.2.4 甲基化分析 通過在線甲基化分析及引物設(shè)計軟件(MethPrimer)分析插入T-DNA片段最可能發(fā)生甲基化的片段并設(shè)計引物。取正常培養(yǎng)基上生長10 d的Col-0及L22-8擬南芥幼苗用CTAB法提取DNA，經(jīng)甲基化變性試劑盒EZDNA Methylation-Gold kit對Col-0和L22-8基因組DNA進行亞硫酸氫鹽變性，并用軟件設(shè)計的引物擴增。擴增條帶經(jīng)凝膠回收(Axygen AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)后連接pEASY-Blunt Zero克隆載體，分別取Col-0和L22-8的6個克隆進行測序分析。引物序列：-Fb：5’-TTTAATTTTAAAAGTTTAATATTGGT-GA-3’，-Rb： 5’-CAAAATCCATACATA-AACTACTTTTT-3’。

1.2.5 插入位點的鑒定 根據(jù)pCAMBIA2300載體選取EcoRⅠ與EcoRⅤ同時酶切Col-0與L22-8株系DNA，通過T4連接酶將酶切片段連接成環(huán)，在pCAMBIA2300載體上設(shè)計引物擴增環(huán)狀DNA片段得L22-8特異條帶，擴增引物：p2300-LB-S：5’- TGCCTCGTCCTGGAGTTCAT-3’，p2300-LB-A：5’- AGCGTTGGCTACCCGTGATA-3’。膠回收(Axygen AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)目標片段連接到pEASY-Blunt Zero克隆載體，測序后比對確定T-DNA插入位點。

1.2.6 植物總磷、總鐵、總鋅含量測定 將在正常培養(yǎng)基上生長21 d的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至正常及缺鐵培養(yǎng)基繼續(xù)生長5 d，取地上部，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重，用HNO3-H2O2消煮[23]至澄清的消解液，用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP)對P、Fe、Zn元素含量進行檢測?？偣策M行3個生物學重復。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Excel 2007進行數(shù)據(jù)的處理并統(tǒng)計分析，TTEST檢測以<0.01為極顯著差異，用“**”表示，以<0.05為顯著差異，用“*”表示。圖表用Origin 8.0生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 L22-8的發(fā)現(xiàn)及檢測

在轉(zhuǎn)基因篩選單拷貝純合株系過程中發(fā)現(xiàn)突變體L22-8。如圖2A顯示，L22-8表現(xiàn)為在正常生長條件下熒光信號強烈高于其他純合株系(如L10-9等)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，L22-8在缺鐵處理下雖然仍會被強烈誘導，但無論在正常生長條件下還是缺鐵處理下L22-8熒光信號均強烈高于L10-9(圖2B)。半定量檢測結(jié)果表明，外源基因轉(zhuǎn)錄表達在正常和缺鐵處理下的地上部與正常生長條件下的地下部均明顯高于L10-9(圖2C)。

圖2 突變體的獲得及進一步驗證

2.2 突變體內(nèi)源基因CYP82C4的表達差異

為確定突變體L22-8內(nèi)源基因是否發(fā)生變化，我們使用實時定量PCR對轉(zhuǎn)錄表達進行了檢測。圖3顯示，地下部基因的表達量表現(xiàn)為，正常生長條件下，L22-8高于Col-0，但缺鐵處理下，L22-8與Col-0沒有表現(xiàn)出顯著差異。地上部基因的表達量表現(xiàn)為，無論正常生長條件下還是缺鐵處理下，L22-8均顯著高于Col-0。

2.3 幾種響應(yīng)缺鐵脅迫標記基因的定量檢測

為確定缺鐵響應(yīng)標記基因的表達在L22-8中是否發(fā)生改變，通過實時定量PCR方法對植株地下部幾種響應(yīng)鐵缺乏主要的標記基因的轉(zhuǎn)錄表達進行了檢測。結(jié)果如圖4顯示，突變體L22-8缺鐵處理下的表達量明顯高于Col-0，而在缺鐵處理條件下受調(diào)控的鐵吸收相關(guān)Marker基因與在L22-8中的表達量沒有發(fā)生顯著差異。在正常生長條件下，L22-8中與的表達量均沒有表現(xiàn)出與Col-0的顯著不同，僅的表達量略高于Col-0。但無論在正常生長條件還是缺鐵處理下，L22-8株系中與互作的轉(zhuǎn)錄因子和的表達量，均明顯高于Col-0。

(*，** 代表t-test檢驗的顯著性差異，*：P<0.05，**：P<0.01，下同)

圖4 Fe Marker基因的檢測

2.4 突變體P、Fe、Zn元素的測定

L22-8株系基因及響應(yīng)缺鐵脅迫標記基因表達量的改變可能影響植株對鐵元素的吸收及積累。因為P、Zn元素對Fe元素起拮抗作用，我們同時對L22-8及Col-0地上部總Fe、總P、總Zn含量進行了測定。如圖5結(jié)果表明，無論在正常生長條件下還是缺鐵處理下，突變體L22-8株系的總Fe、P、Zn含量與野生型相比均沒有表現(xiàn)出顯著性差異，說明突變體雖影響了某些響應(yīng)缺鐵脅迫基因的表達，但并不影響植株對環(huán)境中鐵元素的積累。

2.5 甲基化對熒光信號的影響分析

從前面的研究結(jié)果得知，L22-8雖影響到內(nèi)源基因及幾種鐵響應(yīng)Marker基因的轉(zhuǎn)錄表達，但在元素測定上并未表現(xiàn)出差異，而DNA甲基化對基因的表達起到一定調(diào)控作用[24]。為確定L22-8熒光信號的變化是否與T-DNA中基因啟動子的甲基化改變有關(guān)，我們對該啟動子序列進行了甲基化分析。圖6測序比對結(jié)果表明，在軟件分析的可能發(fā)生甲基化的5個CpG位點中，L22-8基本與Col-0測序結(jié)果一致，均未發(fā)現(xiàn)有甲基化發(fā)生。表明，L22-8熒光信號的增強不是由甲基化變化導致。

圖5 總Fe、P、Zn元素含量檢測

圖6 甲基化分析

2.6 突變體L22-8株系T-DNA插入位點的鑒定及相關(guān)基因表達檢測

運用反向PCR方法，鑒定了突變體L22-8株系的T-DNA插入位點。圖7A顯示，T-DNA插入于和之間。為了確定T-DNA插入是否影響到側(cè)翼基因的轉(zhuǎn)錄表達，對側(cè)翼基因的表達進行了實時定量PCR檢測。圖7B顯示，正常生長情況下L22-8的和兩個基因的表達量顯著降低，而缺鐵處理下未發(fā)生顯著性改變，且發(fā)現(xiàn)兩個基因均不響應(yīng)缺鐵脅迫。

2.7 互補實驗純合株系的獲得與熒光檢測

為確定導致L22-8熒光信號變化的基因，分別轉(zhuǎn)化L22-8獲得兩個基因的單拷貝純合互補株系，記為L5-1~6、L6-1~6，并進行熒光檢測。結(jié)果如圖8所示，基因的多數(shù)互補株系熒光信號強烈，表明該基因未產(chǎn)生互補作用；基因互補株系的熒光信號明顯弱于L22-8株系，起到部分互補作用。表明L22-8株系可能通過影響側(cè)翼基因的作用進而影響到目標基因的表達。

圖8 正常生長條件下側(cè)翼基因互補株系的熒光檢測

3 討論

為促進植物對土壤中鐵元素的吸收、利用，近年已實踐應(yīng)用了多種措施，如新的鐵螯合劑的使用，不同耕作措施的實施及基因改造等[22]。植物鐵調(diào)控機制的研究表明，除了眾多缺鐵響應(yīng)基因參與植物鐵平衡調(diào)控外，許多調(diào)控植物生長的信號分子也參與調(diào)控缺鐵過程，如：乙烯、NO、生長素、茉莉酸等[25-28]，植物體內(nèi)擁有一個十分復雜的鐵平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。盡管我們已經(jīng)在植物鐵吸收、運輸?shù)确肿訖C制方面取得重要的進展，但植物體內(nèi)應(yīng)該存在有新的調(diào)控因子并需要我們的探索，特別是負調(diào)控因子的探索。例如雖然我們已知FIT是正調(diào)控缺鐵脅迫的核心調(diào)控因子，但受FIT調(diào)控響應(yīng)缺鐵脅迫的基因僅占眾多鐵響應(yīng)基因的一部分[7,29]，仍有很多鐵響應(yīng)基因的調(diào)控因子尚不清晰。

本文通過分離基因的啟動子，再連接報告基因構(gòu)成基因的表達載體pCAMBIA2300-::以轉(zhuǎn)化擬南芥，進而通過T-DNA隨機插入得到了一個響應(yīng)缺鐵信號的擬南芥突變體庫；通過篩選突變體庫我們得到了一個強烈響應(yīng)缺鐵信號的株系L22-8；根據(jù)對突變體T-DNA插入位點的確定，進一步探討影響基因表達可能存在的新的調(diào)控因子。通過篩選突變體找到突變基因并進行基因功能研究的正向遺傳學方法是將表型與其潛在的基因聯(lián)系起來的最成功的策略之一[30]，是發(fā)現(xiàn)基因、研究基因功能非常有效的手段。而T-DNA插入突變篩選突變體庫的方法，因其T-DNA序列已知，具有插入突變體易定位的優(yōu)點，且?guī)в袌蟾婊虻腡-DNA則更易篩選檢測[31]。2016年Shinde等[32]研究中就運用正向遺傳學方法篩選突變體，用作為報告基因，取得良好的研究結(jié)果，亦適用于本研究。本研究通過篩選T-DNA插入突變體庫，發(fā)現(xiàn)了突變體L22-8，并證明由于T-DNA的插入影響了目標基因的表達，使得L22-8在正常生長條件下就表現(xiàn)出缺鐵反應(yīng)，且在缺鐵處理條件下發(fā)現(xiàn)L22-8地下部基因的表達量未發(fā)生變化，但地上部的表達量卻顯著高于Col-0。我們推測這可能是因為缺鐵處理下在地下部的本底表達量就已經(jīng)很高，使得地下部未表現(xiàn)出差異，而在表達量變化較低的地上部則能表現(xiàn)出顯著性差異，或可能由于T-DNA的插入影響了L22-8的地下部對缺鐵脅迫的部分響應(yīng)，降低了變化幅度。此外，通過實驗證明由于T-DNA的插入影響了幾種關(guān)鍵缺鐵響應(yīng)標記基因的轉(zhuǎn)錄表達，如和等。而FIT可與AtbHLH38、AtbHLH39等形成異源二聚體，有效地誘導和基因的表達[17-18]，由本研究結(jié)果推測基因可能在bHLH38、bHLH39與FIT形成異源二聚體的過程中發(fā)揮作用，參與調(diào)控因子之間的信號傳導。研究結(jié)果分析得知L22-8株系中受FIT調(diào)控的下游鐵吸收相關(guān)基因與的表達量并沒有表現(xiàn)出明顯的不同，僅正常生長條件下L22-8的表達量表現(xiàn)為略高于Col-0。地上部總鐵含量與野生型沒有顯著差異，暗示基因組中可能存在的互作基因，共同參與對缺鐵脅迫的調(diào)控。結(jié)合已有的研究結(jié)果[20]進一步證明，基因并不是響應(yīng)缺鐵脅迫的關(guān)鍵基因，這也是本研究中并未發(fā)現(xiàn)L22-8出現(xiàn)顯著異常表型的原因之一。轉(zhuǎn)基因互補實驗證明側(cè)翼基因?qū)22-8株系的熒光信號起到一定的互補作用，影響到基因的表達?；蛴置?，屬BZIP家族，在鹽脅迫環(huán)境中會被誘導表達。BZIP家族中BZIP19、BZIP23與BZIP24同屬BZIP家族中的F組，啟動子具有相同的結(jié)構(gòu)域[33]。有研究表明、基因在響應(yīng)缺鋅脅迫時會顯著被誘導，但未發(fā)現(xiàn)對缺鋅脅迫的明顯響應(yīng)[34]。缺鐵時植物通過提高的表達間接性增強植株對Zn的積累，過量的Zn會導致植株的生理性Fe缺乏[35-36]。本研究結(jié)果表明，基因組中可能存在的互作基因影響了其對缺鋅脅迫的響應(yīng)，而鋅信號的變化導致基因表達發(fā)生變化，從而間接對響應(yīng)缺鐵脅迫造成影響，即其并不直接對基因響應(yīng)缺鐵脅迫起上游調(diào)控作用。這可能導致了研究結(jié)果中L22-8插入位點雖影響了側(cè)翼基因的表達，但側(cè)翼基因在實驗中的培養(yǎng)時間內(nèi)對缺鐵脅迫并沒有明顯響應(yīng)的現(xiàn)象。

綜上所述，我們篩選到了一個強烈響應(yīng)缺鐵信號的突變體L22-8，并進一步分析發(fā)現(xiàn)，可能是T-DNA的插入導致鋅信號響應(yīng)基因的表達發(fā)生變化，而進一步引起L22-8對缺鐵信號的響應(yīng)，但具體的作用方式和機制還需后續(xù)實驗進一步探索。

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Screening and Characterization of anMutant in Response to Iron Deficiency

WANG Lisai1,2, YAN Mingke1,2, WANG Han1, SHEN Renfang1, LAN Ping1*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Iron is an essential nutrient for plant growth, but also a limiting factor for crop production due to its low solubility and availability in soil. The expression of a variety of genes would be induced under iron deficiency, while to many of these genes, the mechanisms remains unclear.() is one of the iron starvation induced gene and regulated byin. In this study, the promotor ofwas linked to Luciferase to screen the T-DNA insertion mutant library for genes in response to iron deficiency in. After screening, a line L22-8 was identified to remarkably intensify the fluorescence ofin both iron sufficient and deficient conditions. Real time qPCR analysis showed that the expression levels of endogenouswas increasedin root and shoot under normal growth condition, and in shoot underiron deficiency condition, but not the shoot in shortage of iron. The expression of several Fe-marker genes, such as,and, et al., were also significantly changed. These results indicated that the T-DNA insertion of L22-8 affected the molecular response ofto iron deficiency stress andmay play an important role in the formation of heterodimer ofwithand. The T-DNA insertion site of the L22-8 strain was detected to be located betweenandby reverse PCR, and the transcriptional expression of these two genes was slightly lower in mutant than Col-0 under normal conditions. Complementary analysis confirmed thatcould partially recover the L22-8 fluorescence signal, suggesting its role in regulating the response ofto iron deficiency stress. In addition, the contents of total Fe, P and Zn in shoot of L22-8 had no differences compared with Col-0, indicating that there maybe exsit someotherinteractive genes ofinOur results further extend the molecular regulation network of iron uptake and utilization in plant, and provide guidance for molecular breeding.

Soil;Iron-deficiency stress; Mutant characterization; Molecular regulation

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0200308)和國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2015CB150501)資助。

(plan@issas.ac.cn)

王立賽(1990—)，女，山東德州人，碩士研究生，主要從事植物營養(yǎng)分子生物學研究。E-mail：1527951097@qq.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.03.006

Q945.1

A