申利 楊辛蘭 張力思 河春姬 周鑫淼 徐友宣 閆寬

1國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

2北京體育大學(xué)

人生長(zhǎng)激素（hGH)是有促進(jìn)代謝和生長(zhǎng)作用的內(nèi)分泌激素，主要作用是刺激骨骼和軀體生長(zhǎng)，并對(duì)機(jī)體的新陳代謝發(fā)揮重要影響，運(yùn)動(dòng)員濫用生長(zhǎng)激素可加速蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)脂肪分解燃燒，減少葡萄糖的消耗。因此，生長(zhǎng)激素早已被世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WA?DA）列入禁用清單[1]，反興奮劑實(shí)驗(yàn)室也對(duì)此物質(zhì)實(shí)施了有效的檢測(cè)。因此，有運(yùn)動(dòng)員轉(zhuǎn)向?qū)ふ腋印半[蔽”的物質(zhì)來(lái)提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)，逃避檢查。

近些年來(lái)，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展極大地加速了肽治療學(xué)的飛速增長(zhǎng)。生產(chǎn)技術(shù)的革新使得小肽的合成更加簡(jiǎn)單化，用于不同治療目的的小肽類(lèi)物質(zhì)大量涌入市場(chǎng)。體育運(yùn)動(dòng)中的藥物濫用也聚焦于此類(lèi)物質(zhì)。如生長(zhǎng)激素釋放肽（GHRP）和生長(zhǎng)激素促分泌素（GHS）等物質(zhì)。有大量的宣傳指出此類(lèi)物質(zhì)可作用于大腦垂體，刺激人體自身生長(zhǎng)激素的分泌，延緩衰老，幫助燃燒脂肪，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高免疫力，增強(qiáng)肌肉力量，而這些“功能”正是有些運(yùn)動(dòng)員的關(guān)注點(diǎn)，此類(lèi)物質(zhì)也成為藥物濫用的新熱點(diǎn)。為了維護(hù)體育運(yùn)動(dòng)的純潔和公平競(jìng)賽，WADA陸續(xù)將此類(lèi)物質(zhì)列入禁用清單，并在技術(shù)文件中規(guī)定了其檢測(cè)能力最低要求（MRPL）為2 ng/mL【2】。2010年檢測(cè)人血漿中GHRP-2和Hexarelin的方法問(wèn)世，使用50 μL血漿可獲得10 ng/ml的檢測(cè)限【3】。同年，Okano等人還報(bào)道了從人尿中檢出GHRH-2（pralmorelin)及其主要代謝物（D-Ala-D-betaNal-Ala）的方法【4】，還有報(bào)道可檢測(cè)尿中8種GHRHs和GHRH-2的主要代謝物，尿樣使用弱陽(yáng)離子SPE萃取，LC-HRMS（液相色譜－高分辨質(zhì)譜)檢測(cè)【5，6】。

目前我實(shí)驗(yàn)室采用LC-MS/MS方法進(jìn)行多種物質(zhì)的初篩及確證檢測(cè)【7-9】，但對(duì)小肽類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)尚無(wú)適合的檢測(cè)方法。而WADA已要求其認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室從2016年3月開(kāi)始開(kāi)展此類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)工作。為了滿(mǎn)足WADA實(shí)驗(yàn)室國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)文件要求，保持實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可資格，建立小肽類(lèi)生長(zhǎng)激素釋放物質(zhì)的檢測(cè)方法極為必要和緊迫。

本研究選取了7種GHRP（GHRP-1,GHRP-2,GHRP-4,GHRP-5,GHRP-6,Hexarelin和Alexamore?lin）和兩種GHS（Anamorelin和Ipamorelin）為研究對(duì)象，通過(guò)簡(jiǎn)單的前處理步驟對(duì)尿樣進(jìn)行前處理，利用HPLC-MS/MS技術(shù)的良好分離能力和高選擇性建立人尿中這9種禁用物質(zhì)的檢測(cè)方法并應(yīng)用于興奮劑檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的日常工作中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

GHRP-1,GHRP-4 和 GHRP-5：Abbiotec（美國(guó))，GHRP-6：PROSPEC（以色列)，Hexarelin：US Biological（美國(guó)），Alexamorelin：Auspep（澳大利亞），GHRP-2，Anamorelin和 Ipamorelin：國(guó)產(chǎn)；（Deamino-cys1,val4,D-arg8）-Vasopressin,簡(jiǎn)稱(chēng)為DCVDV，內(nèi)標(biāo)，吉爾生化上海有限公司。

固相提取柱：Oasis?WCX Cartridge固相提取柱（1 cc,30 mg），20位固相提取裝置：沃特世科技（上海)有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）:DIKMA TECHNOLO?GY Inc.美國(guó)；氨水（NH4OH）：國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

對(duì)于單包裝內(nèi)總量小于等于5 mg的標(biāo)準(zhǔn)品，直接向標(biāo)準(zhǔn)品包裝瓶?jī)?nèi)加入1 mL 1%甲酸乙腈/水（1︰1）溶液，壓緊蓋子，小心渦旋混勻，根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)品的量配制成1 mg/mL，2 mg/mL或5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；

對(duì)于單包裝內(nèi)總量大于5 mg的標(biāo)準(zhǔn)品，使用十萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱(chēng)量0.8～1.5 mg標(biāo)準(zhǔn)品于離心管中，記錄稱(chēng)量的準(zhǔn)確數(shù)值x.xx mg；使用1 mL移液槍移取與稱(chēng)量的準(zhǔn)確數(shù)值1︰1（mg:mL)對(duì)應(yīng)體積的1%甲酸乙腈/水（1︰1）溶液于標(biāo)準(zhǔn)品離心管中（＞1 mL時(shí)分次吸?。?，壓緊蓋子，小心渦旋混勻，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

各儲(chǔ)備液分別倍比稀釋為100 ng/μL、10 ng/μL和1 ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。內(nèi)標(biāo)溶液倍比稀釋為0.5 ng/μL備用。

各取100 μL 10 ng/μL單標(biāo)溶液，加入2 mL低吸附離心管中，35℃氮?dú)饬飨滦⌒拇蹈桑尤? mL 1%甲酸乙腈/水（1︰1）溶液，壓緊蓋子，小心渦旋混勻，即為1 ng/μL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入900μL標(biāo)準(zhǔn)品溶劑稀釋為0.1ng/μL的混標(biāo)溶液備用。

1.3 陽(yáng)性質(zhì)量控制樣品（QCP QCP）的制備

分別量取15 μL、30 μL或150 μL 0.1 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入到1.5 mL空白尿中，渦旋混勻即配制濃度分別為1 ng/mL、2 ng/mL或10 ng/mL的QCP。

1.4 儀器設(shè)備與條件

使用1290/6470 Triple Quad液相色譜質(zhì)譜儀（Agilent，美國(guó)）進(jìn)行定性分析，色譜柱：Zorbax 300SBC181.0 mm×50 mm×3.5 mm ，色譜柱保護(hù)柱：Zorbax Stablebond均為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。流動(dòng)相A為0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.2%甲酸乙腈溶液，洗脫題度為：0～1.5 min:90%A,1.5～2.0 min:80%A,2.0～8.0 min:60%A,8.0～8.1 min:10%A,8.1～10 min:10%，流速為0.25 mL／min，平衡4 min，進(jìn)樣量10 μL。質(zhì)譜檢測(cè)采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)離子檢測(cè)（Dynam?ic－MRM），電噴霧（ESI）正離子模式，毛細(xì)管電壓4000 V，干燥氣溫度325℃，干燥氣流速10.0 mL/min。

1.5 尿樣前處理

1.5.1 固相萃?。菏褂肙asis?WCX固相提取小柱（1 cc,30 mg）進(jìn)行固相提取，先使用1 mL甲醇活化小柱，再用1 mL純水平衡，1.5 mL尿樣加入10 μL IS溶液，離心（10000 rpm）10分鐘后，取1 mL上清液加入小柱，使用1 mL 5%NH4OH和1 mL 20%CH3CN依次清洗后，采用1 mL 含2%甲酸的H2O/CH3CN（1/3）洗脫液洗脫，35℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶后進(jìn)樣10 μL于LC-MS/MS。

1.5.2 直接進(jìn)樣：90 μL尿樣加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液后，直接進(jìn)樣于HPLC-MS/MS。

2 研究結(jié)果

2.1 質(zhì)譜色譜數(shù)據(jù)

經(jīng)質(zhì)譜色譜條件優(yōu)化后，得到待分析物的檢測(cè)數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1。

2.2 檢測(cè)物質(zhì)MRM MRM質(zhì)譜圖（2 2 ng/mL ng/mL質(zhì)量控制尿樣固相提取后）

圖1 9種GHRP和GHS的MRM質(zhì)譜圖

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 檢測(cè)限（LOD LOD）

取10份不同來(lái)源的空白尿，加入較低濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)固相提取和直接進(jìn)樣法前處理后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，選擇信噪比大于3的濃度為L(zhǎng)OD。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 回收率（Recovery overy）

配制3種濃度（1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL）的控制尿樣，各取10份與10份空白尿一起進(jìn)行固相提取前處理，氮?dú)獯蹈珊蠹尤胂嗤康膬?nèi)標(biāo)后進(jìn)行儀器分析，根據(jù)待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值計(jì)算回收率，按照下述公式進(jìn)行計(jì)算（CV小于20%）：

回收率＝峰面積B/內(nèi)標(biāo)峰面積÷峰面積A/內(nèi)標(biāo)峰面積×100%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 精密度（Precision ision）

配制各物質(zhì)不同濃度（1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL）的控制尿樣，各取5份，按前述方法進(jìn)行分析。根據(jù)待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和CV，以CV（%)代表精密度。通過(guò)兩位操作者實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)計(jì)算獲得日內(nèi)精密度。所有CV值均小于20%。

上述方法每天操作一次，共3次，比較3次數(shù)據(jù)，得到日間精密度。CV值亦小于20%。精密度要求符合WADA技術(shù)文件要求。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9種WADA禁用物質(zhì)的檢測(cè)限、回收率及精密度

同樣按照1.5.2方法直接進(jìn)樣，得到直接進(jìn)樣法的日內(nèi)及日間精密度。

2.3.4 選擇性（Specificity icity）

選擇50份空白尿樣，經(jīng)固相提取前處理后上機(jī)檢測(cè)，觀察尿樣中基質(zhì)對(duì)待測(cè)離子窗口的影響。結(jié)果表明，本方法中尿中基質(zhì)無(wú)明顯干擾，確定該方法選擇性良好。

直 接 進(jìn)樣法在 GHRP-1、GHRP-4、GHRP-5、GHRP-6、Hexarelin和Ipamorelin窗口有干擾。

2.3.5 穩(wěn)定性

使用3份不同的空白尿配制10 ng/mL的控制尿樣各3份，使用穩(wěn)定物質(zhì)甲睪做內(nèi)標(biāo)，按照不同的儲(chǔ)存條件（室溫、冷藏和冷凍）和時(shí)間分別取出直接上樣分析，以新配制的QCP為基準(zhǔn)，得到不同儲(chǔ)存條件下測(cè)得結(jié)果的變化值（n=3），以測(cè)定值與新配制QCP的比值表示，見(jiàn)圖2。

3 研究結(jié)論與建議

3.1 尿樣的分離純化

圖2不同儲(chǔ)存條件下禁用物質(zhì)尿中濃度隨時(shí)間的變化

蒙特利爾、里約等WADA認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室采用直接進(jìn)樣法檢測(cè)小肽類(lèi)禁用物質(zhì)，具體方法為使用90 μL尿樣直接加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液后，進(jìn)樣于LC-HRMS。本研究使用此方法進(jìn)行了尿樣的分析，發(fā)現(xiàn)使用Agilent 1290/6470 LC-MS/MS檢測(cè)時(shí)，GHRP-1、Hexarelin和Ipamorelin的LOD不能滿(mǎn)足WADA技術(shù)文件要求，而且GHRP-1、GHRP-4、GHRP-5、GHRP-6、Hexarelin和Ipamorelin窗口有干擾，有約30%的樣品呈現(xiàn)疑似陽(yáng)性結(jié)果，需要確證。常規(guī)檢測(cè)時(shí)這種情況需要耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間。因此認(rèn)為直接進(jìn)樣法不適合我實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)。

GHRP和GHS類(lèi)物質(zhì)多為親水性小肽類(lèi)物質(zhì)，使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取需要復(fù)雜的多個(gè)步驟，且回收率差，靈敏度不能滿(mǎn)足要求。固相萃取（SPE）技術(shù)可有效地減少分析物的污染，節(jié)約溶劑消耗，縮短樣品前處理時(shí)間，因而在生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域得到了具體的應(yīng)用。在興奮劑檢測(cè)領(lǐng)域，SPE的應(yīng)用也較為廣泛【5】，作為有效的樣品分離純化手段，SPE可降低尿樣或血樣等生物樣本中的基質(zhì)干擾，改善分析物的色譜質(zhì)譜響應(yīng)，提高檢測(cè)靈敏度和特異性。目前，Waters公司的Oasis SPE提取材料是公認(rèn)的分離純化小肽類(lèi)物質(zhì)的良好工具，WCX固相提取柱為混合性弱陽(yáng)離子交換與反相保留吸附劑，對(duì)于堿性分析物具有高度選擇性與高回收率。本研究經(jīng)過(guò)比較不同的Oasis產(chǎn)品，選取了可兼顧各分析物的WCX小柱進(jìn)行固相提取，綜合尿樣量和WADA MRPL要求，使用1 cc、30 mg規(guī)格，回收率令人滿(mǎn)意。

3.2 色譜條件的選擇

由于SPE提取物濃縮比例高（10︰1），成分較為復(fù)雜，因而經(jīng)過(guò)比較選用了大孔徑的Zorbax 300SB-C181.0 mm id×50 mm×3.5 mm 色譜柱，并增加了Zorbax Stablebond作為保護(hù)柱。使用甲酸水溶液/甲酸乙腈溶液（pH值約為2.5）為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫，盡可能地保證了分析物的良好分離。由表1可見(jiàn)，此9種禁用物質(zhì)的保留時(shí)間分布在2.2～5.7分鐘范圍，由圖1可見(jiàn)在MRPL濃度時(shí)色譜峰峰形良好，MRM譜圖清晰，在興奮劑檢測(cè)大量樣品初篩時(shí)方便檢測(cè)人員查驗(yàn)，可有效避免陽(yáng)性樣品誤判為陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

通過(guò)參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，選取2～3個(gè)豐度較高、干擾較少的離子對(duì)作為定性離子對(duì)。由于此類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生相同的碎片離子，使用普通的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式互相干擾。經(jīng)過(guò)比較使用了動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，有效地改善了峰形，降低了噪音，保證了初篩檢測(cè)的靈敏度能滿(mǎn)足WADA技術(shù)文件有關(guān)MRPL的要求。確保樣品檢測(cè)結(jié)果的正確。

3.4 分析物在尿樣中的穩(wěn)定性

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，直接進(jìn)樣法的LOD不能滿(mǎn)足WADA TD-MRPL要求，但在10 ng/mL濃度下，這9種物質(zhì)的日內(nèi)日間精密度均＜15%，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。本研究采用直接進(jìn)樣法對(duì)尿中9種GHRPs和GHS在 不同溫度條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究。

與其他小分子禁用物質(zhì)相比，肽類(lèi)物質(zhì)為氨基酸組成的肽鏈，對(duì)環(huán)境較為敏感，溫度和樣品形態(tài)的變化可能會(huì)對(duì)其在尿中的穩(wěn)定性造成影響，從而影響實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的準(zhǔn)確性及初篩、確證及B瓶檢測(cè)結(jié)果的一致性。因而穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)非常重要也十分必要。本研究結(jié)果顯示Anamorelin、GHRP-2、GHRP-4和GHRP-5對(duì)溫度時(shí)間的變化較敏感，室溫儲(chǔ)存和冷藏條件下放置48小時(shí)后尿中濃度開(kāi)始顯著下降，冷凍條件下反復(fù)凍融也會(huì)引起尿中濃度的下降。提示為了更準(zhǔn)確有效地檢測(cè)GHRP和GHS類(lèi)禁用物質(zhì)，應(yīng)注意運(yùn)動(dòng)員尿樣在采集后盡快傳送至實(shí)驗(yàn)室，而小肽類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)應(yīng)在尿樣到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后盡快進(jìn)行，尿樣在傳送或郵遞及實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存過(guò)程中應(yīng)保持全程冷凍并盡量避免反復(fù)凍融。

4 結(jié)論

尿樣經(jīng)Oasis WCX小柱進(jìn)行前處理后，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，經(jīng)過(guò)色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了使用我實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備對(duì)9種生長(zhǎng)激素釋放肽和生長(zhǎng)激素促分泌素的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單，特異性、靈敏度均可滿(mǎn)足WADA實(shí)驗(yàn)室國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)文件要求?，F(xiàn)已應(yīng)用于我實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)。