閻成全， 才勝勇， 孟 斌， 王鵬飛， 李 林， 趙超飛， 劉逸飛， 孟 昕

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院泌尿外科，河北 唐山 063007)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是全球男性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位居所有惡性腫瘤的第2位和第6位[1]。流行病學(xué)資料表明，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年增加趨勢(shì)[2]，好發(fā)于50歲以上的男性[3]。目前前列腺癌的治療方法包括手術(shù)切除、放化療和內(nèi)分泌治療，但這些方法對(duì)晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌的預(yù)后效果較差，且易復(fù)發(fā)，患者表現(xiàn)出對(duì)放療和化療藥物的耐藥性。因此，尋找和研發(fā)有效治療前列腺癌的靶向藥物迫在眉睫。

微小RNA(microRNAs，miRNAs，miR)是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常表達(dá)與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲及耐藥等方面發(fā)揮重要作用[4-6]。miR-29a是最新研究發(fā)現(xiàn)的miR-29s家族成員之一，miR-29s在急性淋巴瘤[7]、慢性淋巴細(xì)胞白血病[8]、鼻咽癌[9]和乳腺癌[10]中低表達(dá)，表明miR-29a可能是一個(gè)腫瘤相關(guān)因子并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。下調(diào)miR-29a可抑制p85a和CDC42的表達(dá)進(jìn)而降低p53的抗凋亡活性，導(dǎo)致細(xì)胞惡性表型[11]；miR-29a低表達(dá)能抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methylatransferase,DNMT)3A/3B的活性以及胞外蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]。miR-29a的異常表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的惡性表型密切相關(guān)，目前miR-29a在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能鮮有報(bào)道。Li等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸(K)特異性去甲基化酶[lysine (K)-specific demethylase, KDM]5B在前列腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，miR-29a與KDM5B mRNA的3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3’UTR)結(jié)合可抑制KDM5B的表達(dá)，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。KDM4B是KDM家族成員之一，是組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化(H3K4me3)的主要去甲基化酶，研究發(fā)現(xiàn)H3K4me3的水平與前列腺癌的低分化有關(guān)[14]。目前關(guān)于KDM4B在前列腺癌中的生物學(xué)功能仍不清楚。本研究運(yùn)用基因芯片、生物信息學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)探討miR-29a在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制，為以miR-29a為靶點(diǎn)研發(fā)治療前列腺癌的靶向藥物提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

選取2005～2015年唐山市工人醫(yī)院泌尿外科前列腺癌手術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為前列腺癌的組織標(biāo)本，其中前列腺癌組織33例，癌旁組織28例。用于miRNA提取的組織經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)及恥骨弓上前列腺切除術(shù)中迅速收集，置于液氮中保存。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署患者知情同意書。

人前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145、LNCaP和ArCaP及正常前列腺細(xì)胞株RWPE-1購(gòu)自ATCC；高糖型DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白酶、MTT和DMSO購(gòu)自Sigma；Transwell 板購(gòu)自Corning；脂質(zhì)體2000購(gòu)自Invitrogen；抗KDM4B抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗GAPDH抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒、mirVana miRNA分離試劑盒和TaqMan miRNA試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Era-ser)和real-time PCR 試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ)購(gòu)于TaKaRa；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo。

2 方法

2.1miRNA芯片的篩選 按照mirVana miRNA試劑盒說明書提取前列腺癌組織和癌旁組織中的miRNA,送公司進(jìn)行miRNA芯片雜交掃描，采用Agilent Human miRNA Microarray Rel12.0單標(biāo)芯片,按公司規(guī)定要求進(jìn)行標(biāo)記和雜交，結(jié)果由Agilent Scan Control軟件和儀器進(jìn)行掃描，圖像經(jīng)Agilent Feature Extraction 9.5.3 軟件進(jìn)行處理分析，輸出原始表達(dá)數(shù)據(jù)。運(yùn)用GeneSpring 11軟件導(dǎo)入上述原始數(shù)據(jù),處理生成歸一化數(shù)據(jù)。設(shè)定樣本的屬性，配對(duì)統(tǒng)計(jì)輸出P<0.05，差異倍數(shù)>1.5的miRNA分子。運(yùn)用Cluster 3.0進(jìn)行聚類分析，將miRNA依照各自的表達(dá)譜自主歸入相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈中，通過生物信息學(xué)方法(TargetScan、Gene Ontology和Pathway Analysis)挖掘和篩選前列腺癌組織和癌旁組織中具有差異表達(dá)的miRNA作為后續(xù)研究靶點(diǎn)。

2.2Real-time PCR 將生長(zhǎng)良好的PC3、DU145、LNCaP、ArCaP和RWPE-1細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以細(xì)胞密度為每孔1×106個(gè)接種到10 cm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)收集細(xì)胞；并取前列腺癌組織和癌旁組織各30 mg于研磨器中，加入液氮研磨至勻漿，按照mirVana miRNA分離試劑盒提取細(xì)胞和組織中miRNA；運(yùn)用TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-29a的表達(dá)，采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行real-time PCR數(shù)據(jù)分析，引物序列見表1。miR-29a結(jié)果經(jīng)U6校正，KDM4B的mRNA表達(dá)經(jīng)GAPDH校正，兩者相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 Real-time PCR引物序列

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pGenesil-1-miR-29a表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。將生長(zhǎng)良好的PC3、DU145、LNCaP和ArCaP細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以細(xì)胞密度為每孔2×105個(gè)接種到6孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度達(dá)到85%左右時(shí)按照脂質(zhì)體2000說明書進(jìn)行pGenesil-1-miR-29a細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)4 h后換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、DU145-miR-29a和LNCaP-miR-29a；以轉(zhuǎn)染pGenesil-1質(zhì)粒為陰性對(duì)照(negative control,NC)組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對(duì)照(blank control)組，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、LNCaP-miR-29a和ArCaP-miR-29a細(xì)胞及陰性對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)消化計(jì)數(shù)后，以細(xì)胞密度為2.5×107/L接種于96孔板中，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫震蕩5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的吸光度(A)，按下式計(jì)算細(xì)胞活力抑制率：細(xì)胞活力抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

2.5集落形成實(shí)驗(yàn) PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、LNCaP-miR-29a和ArCaP-miR-29a細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞經(jīng)胰酶消化計(jì)數(shù)后，以每皿200個(gè)接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行，培養(yǎng)至通過肉眼能清晰觀察到可見的細(xì)胞克隆(約2周)；將培養(yǎng)基倒掉，PBS洗滌,甲醇固定10 min,PBS洗滌,吉姆薩染色10 min,自來水清洗，晾干后計(jì)數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞集落形成率：集落形成率(%)=細(xì)胞集落平均值/鋪板細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、LNCaP-miR-29a和ArCaP-miR-29a細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后以細(xì)胞密度每孔4×105個(gè)接種到6孔板中，培養(yǎng)72 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，用無EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，加入PBS制成細(xì)胞懸液。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書操作，先加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.7Western blot檢測(cè)蛋白水平 PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、LNCaP-miR-29a和ArCaP-miR-29a細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞經(jīng)消化、離心收集細(xì)胞，用RIPA(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉,0.1% SDS)重懸細(xì)胞，超聲破碎,12 000 r/min、4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說明書測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)樣本取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育 I 抗，以GAPDH為內(nèi)參照，4 ℃過夜。TBST洗膜、孵育 II 抗，室溫孵育1 h。ECL顯影后掃描，蛋白相對(duì)表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參校正后經(jīng)Quantity One軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-29a在前列腺癌及癌旁組織中的差異表達(dá)

運(yùn)用miRNA芯片篩選出在前列腺癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的miRNA,結(jié)果顯示,28種miRNA在前列腺癌組織和癌旁組織中呈不同程度的差異表達(dá)，其中miR-29a在3例前列腺癌組織中的表達(dá)水平與對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平明顯不同，miR-29a在前列腺癌組織中顯著下調(diào)，見圖1A；real-time PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-29a在前列腺癌中的平均表達(dá)水平較癌旁組織顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1B。

Figure 1. The differential expression of miR-29a in prostate cancer tissues and their adjacent tissues. A: miRNA chip screening; B: the expression of miR-29a detected by real-time PCR. PC1: paracarcinomatous tissue 1; PC2: paracarcinomatous tissue 2; PC3: paracarcinomatous tissue 3; T1: prostate cancer tissue 1; T2: prostate cancer tissue 2; T3: prostate cancer tissue 3; PC: paracarcinomatous tissues.

圖1miR-29a在前列腺癌及癌旁組織中的差異表達(dá)

2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染介導(dǎo)miR-29a在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-29a在前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145、LNCaP和ArCaP中的表達(dá)水平均顯著低于RWPE-1細(xì)胞(P<0.01),見圖2A。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pGenesil-1-miR-29a質(zhì)粒48 h后，real-time PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，miR-29a在PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、LNCaP-miR-29a和ArCaP-miR-29a細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖2B。

Figure 2. The expression levels of miR-29a in the prostate cancer cells were detected by real-time PCR. A: the miR-29a expression in different prostate cancer cell lines; B: the miR-29a expression before and after transfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsRWPE-1 group;△△P<0.01vspGenesil-1 group.

圖2Real-timePCR檢測(cè)miR-29a在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

3 miR-29a過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-29a過表達(dá)顯著抑制前列腺癌細(xì)胞活力，轉(zhuǎn)染的4組前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)的細(xì)胞活力，與pGenesil-1組比較均顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 miR-29a過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞集落形成的影響

培養(yǎng)14 d時(shí)，集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-29a過表達(dá)明顯抑制4種前列腺癌細(xì)胞的集落形成能力,見圖4A；PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、LNCaP-miR-29a和ArCaP-miR-29a細(xì)胞的集落形成率與對(duì)照組細(xì)胞比較顯著降低(P<0.05)，見圖4B。

Figure 3. The effect of miR-29a over-expression on the viability of prostate cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspGenesil-1 group.

圖3miR-29a過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞活力的影響

Figure 4. The effect of miR-29a over-expression on colony formation of prostate cancer cells (×20). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspGenesil-1 group.

圖4miR-29a過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞集落形成的影響

5 miR-29a過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC染色及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，miR-29a過表達(dá)顯著誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)，PC3-miR-29a、DU145-miR-29a、LNCaP-miR-29a和ArCaP-miR-29a細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組細(xì)胞顯著升高(P<0.05)，見圖5，提示miR-29a過表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡。

Figure 5. The effect of miR-29a over-expression on the apoptosis of prostate cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspGenesil-1 group.

圖5miR-29a過表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響

6 miR-29a過表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞KDM4B的蛋白水平和細(xì)胞生長(zhǎng)特性

Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM4B的mRNA水平在前列腺癌組織和細(xì)胞中較癌旁組織和正常前列腺細(xì)胞表達(dá)上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，見圖6A、B；Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)KDM4B蛋白水平在前列腺癌組織和細(xì)胞中較癌旁組織和正常前列腺細(xì)胞高表達(dá)(P<0.05),見圖6C、D。為了進(jìn)一步了解miR-29a與KDM4B之間的關(guān)系，我們?cè)趍iR-29a過表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-29a過表達(dá)顯著抑制KDM4B的蛋白水平(P<0.05)，見圖6E；同時(shí)MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-29a過表達(dá)抑制KDM4B蛋白水平的同時(shí)前列腺癌細(xì)胞活力被顯著抑制，細(xì)胞凋亡率顯著增加，而上調(diào)KDM4B的表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)miR-29a過表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的作用，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6F、G。這些結(jié)果提示抑制KDM4B蛋白水平可能是miR-29a過表達(dá)抑制細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制之一。

討 論

miRNA是一種非編碼的短鏈RNA，可以通過降解靶基因和抑制靶基因翻譯來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。miRNA在腫瘤中異常表達(dá)通過對(duì)下游靶基因調(diào)控在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中行使著重要的癌基因或抑癌基因的功能[15]，提示惡性腫瘤的發(fā)生過程與miRNA表達(dá)譜的改變密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥以及代謝等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[16-19]。

miR-29a在多種腫瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)如膽管細(xì)胞癌、急性淋巴瘤、肺癌以及鼻咽癌等[7-10]，提示miR-29a是一個(gè)腫瘤相關(guān)因子參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)恢復(fù)miR-29a的表達(dá)能增強(qiáng)急性淋巴瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡藥物的敏感性[11]；miR-29a過表達(dá)明顯抑制肺癌細(xì)胞的增殖[20]。miR-29a調(diào)控靶蛋白如膠原、轉(zhuǎn)錄因子及甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究基因芯片結(jié)果顯示miR-29a在33例前列腺癌組織中異常表達(dá)，real-time PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-29a在33例前列腺癌組織和4種前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于28例癌旁組織和正常前列腺細(xì)胞，說明miR-29a低表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究miR-29a在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，我們通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使miR-29a在4種前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-29a過表達(dá)顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的活力和集落形成以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明miR-29a是一個(gè)腫瘤抑制因子，抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

越來越多研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，其機(jī)制可能通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控關(guān)鍵靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯影響腫瘤的進(jìn)程[21-22]。通常認(rèn)為表觀遺傳學(xué)機(jī)制不會(huì)改變DNA堿基序列，通過組蛋白修飾和DNA甲基化水平調(diào)控基因表達(dá)[23]。最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[24]。有報(bào)道H3K4me3修飾水平與前列腺癌的低分化有關(guān)[14]，KDM4B是H3K4me3的去甲基化酶，其過表達(dá)能降低H3K4的甲基化水平。研究證實(shí)組蛋白甲基化通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控關(guān)鍵靶基因表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)KDM4B在前列腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道[8]相符。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-29a與KDM4B的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)miR-29a過表達(dá)明顯抑制KDM4B的蛋白表達(dá)，提示KDM4B是miR-29a的作用靶點(diǎn)之一。細(xì)胞表型研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-29a抑制KDM4B表達(dá)，細(xì)胞活力被抑制，細(xì)胞凋亡率明顯增加，同時(shí)KDM4B過表達(dá)時(shí)能部分逆轉(zhuǎn)由miR-29a過表達(dá)對(duì)細(xì)胞的活力和細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果提示miR-29a發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞惡性表型至少部分是通過抑制KDM4B而實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)mi-29a通過抑制KDM5B抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)mi-29a過表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞中上調(diào)KDM4B的表達(dá)只是部分逆轉(zhuǎn)這一作用，提示KDM4B是miR-29a作用靶點(diǎn)之一，還存在其它靶點(diǎn)如KDM5B[13]。miR-29a過表達(dá)可能通過抑制KDM4B的表達(dá)進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此miR-29a是研發(fā)治療前列腺癌藥物的新靶點(diǎn)。本研究為以miR-29a為靶點(diǎn)研發(fā)治療前列腺癌的靶向藥物提供了新思路。

Figure 6. Over-expression of miR-29a inhibited the protein expression of KDM4B and the viability of prostate cancer cells. A: the re-lative mRNA expression of KDM4B in different prostate cancer cell lines; B: the relative mRNA expression of KDM4B in different tissues; C: the protein expression of KDM4B in different prostate cancer cell lines; D: the protein expression of KDM4B in different tissues; E: the protein expression of KDM4B before and after transfection; F: the cell viability before and after transfection; G: the cell apoptosis before and after transfection. PC: paracarcinomatous tissues. Mean±SD.n=3.▲▲P<0.01vsRWPE-1 cells;△P<0.05vsPC group;**P<0.01vspGenesil-1 group;##P<0.01vspGenesil-1-miR-29a group.

圖6miR-29a過表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞KDM4B的蛋白水平和細(xì)胞生長(zhǎng)特性